1、中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B4 7 8 9.22 0 1 6食品安全国家标准食品微生物学检验 菌落总数测定2 0 1 6-1 2-2 3发布2 0 1 7-0 6-2 3实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局发 布G B4 7 8 9.22 0 1 6 前 言 本标准代替G B4 7 8 9.22 0 1 0 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定。G B4 7 8 9.22 0 1 61 食品安全国家标准食品微生物学检验 菌落总数测定1 范围本标准规定了食品中菌落总数(A e r o b i cp l a t e
2、c o u n t)的测定方法。本标准适用于食品中菌落总数的测定。2 术语和定义 菌落总数 a e r o b i cp l a t e c o u n t食品检样经过处理,在一定条件下(如培养基、培养温度和培养时间等)培养后,所得每g(m L)检样中形成的微生物菌落总数。3 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:3.1 恒温培养箱:3 61,3 01。3.2 冰箱:25。3.3 恒温水浴箱:4 61。3.4 天平:感量为0.1g。3.5 均质器。3.6 振荡器。3.7 无菌吸管:1m L(具0.0 1m L刻度)、1 0m L(具0.1m L刻度)或微量移液器及吸
3、头。3.8 无菌锥形瓶:容量2 5 0m L、5 0 0m L。3.9 无菌培养皿:直径9 0mm。3.1 0 p H计或p H比色管或精密p H试纸。3.1 1 放大镜或/和菌落计数器。4 培养基和试剂4.1 平板计数琼脂培养基:见A.1。4.2 磷酸盐缓冲液:见A.2。4.3 无菌生理盐水:见A.3。5 检验程序菌落总数的检验程序见图1。G B4 7 8 9.22 0 1 62 图1 菌落总数的检验程序6 操作步骤6.1 样品的稀释6.1.1 固体和半固体样品:称取2 5g样品置盛有2 2 5m L磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,80 0 0r/m i n 1 00 0 0r/m i
4、 n均质1m i n 2m i n,或放入盛有2 2 5m L稀释液的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1m i n 2m i n,制成11 0的样品匀液。6.1.2 液体样品:以无菌吸管吸取2 5m L样品置盛有2 2 5m L磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成11 0的样品匀液。6.1.3 用1m L无菌吸管或微量移液器吸取11 0样品匀液1m L,沿管壁缓慢注于盛有9m L稀释液的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其G B4 7 8 9.22 0 1 63 混合均匀,制成11 0 0的样品
5、匀液。6.1.4 按6.1.3操作,制备1 0倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次,换用1次1m L无菌吸管或吸头。6.1.5 根据对样品污染状况的估计,选择2个3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),在进行1 0倍递增稀释时,吸取1m L样品匀液于无菌平皿内,每个稀释度做两个平皿。同时,分别吸取1m L空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。6.1.6 及时将1 5m L2 0m L冷却至4 6的平板计数琼脂培养基(可放置于4 61恒温水浴箱中保温)倾注平皿,并转动平皿使其混合均匀。6.2 培养6.2.1 待琼脂凝固后,将平板翻转,3 61培养4 8h2h。水产品3 01培养7 2h3
6、h。6.2.2 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时,可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基(约4m L),凝固后翻转平板,按6.2.1条件进行培养。6.3 菌落计数6.3.1 可用肉眼观察,必要时用放大镜或菌落计数器,记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位(c o l o n y-f o r m i n gu n i t s,C F U)表示。6.3.2 选取菌落数在3 0C F U3 0 0C F U之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于3 0C F U的平板记录具体菌落数,大于3 0 0C F U的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平
7、均数。6.3.3 其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数。6.3.4 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数。7 结果与报告7.1 菌落总数的计算方法7.1.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内,计算两个平板菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数,作为每g(m L)样品中菌落总数结果。7.1.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时,按式(1)计算:N=C(n1+0.1n2)d(
8、1)式中:N 样品中菌落数;C 平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和;n1 第一稀释度(低稀释倍数)平板个数;n2 第二稀释度(高稀释倍数)平板个数;d 稀释因子(第一稀释度)。示例:稀释度11 0 0(第一稀释度)110 0 0(第二稀释度)菌落数(C F U)2 3 2,2 4 43 3,3 5G B4 7 8 9.22 0 1 64 N=C(n1+0.1n2)d=2 3 2+2 4 4+3 3+3 52+(0.12)1 0-2=5 4 40.0 2 2=2 47 2 7 上述数据按7.2.2数字修约后,表示为2 50 0 0或2.51 04。7.1.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大
9、于3 0 0C F U,则对稀释度最高的平板进行计数,其他平板可记录为多不可计,结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。7.1.4 若所有稀释度的平板菌落数均小于3 0C F U,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。7.1.5 若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。7.1.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在3 0C F U3 0 0C F U之间,其中一部分小于3 0C F U或大于3 0 0C F U时,则以最接近3 0C F U或3 0 0C F U的平均菌落数乘以稀释倍数计算。7.2 菌落总数的报告7.2.1 菌落数小于1 0 0C F
10、 U时,按“四舍五入”原则修约,以整数报告。7.2.2 菌落数大于或等于1 0 0C F U时,第3位数字采用“四舍五入”原则修约后,取前2位数字,后面用0代替位数;也可用1 0的指数形式来表示,按“四舍五入”原则修约后,采用两位有效数字。7.2.3 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数,则报告菌落蔓延。7.2.4 若空白对照上有菌落生长,则此次检测结果无效。7.2.5 称重取样以C F U/g为单位报告,体积取样以C F U/m L为单位报告。G B4 7 8 9.22 0 1 65 附 录 A培养基和试剂A.1 平板计数琼脂(p l a t e c o u n t a g a r,P C A)
11、培养基A.1.1 成分胰蛋白胨 5.0g酵母浸膏 2.5g葡萄糖 1.0g琼 脂 1 5.0g蒸馏水 10 0 0m LA.1.2 制法将上述成分加于蒸馏水中,煮沸溶解,调节p H至7.00.2。分装试管或锥形瓶,1 2 1 高压灭菌1 5m i n。A.2 磷酸盐缓冲液A.2.1 成分磷酸二氢钾(KH2P O4)3 4.0g蒸馏水 5 0 0m LA.2.2 制法贮存液:称取3 4.0g的磷酸二氢钾溶于5 0 0m L蒸馏水中,用大约1 7 5m L的1m o l/L氢氧化钠溶液调节p H至7.2,用蒸馏水稀释至10 0 0m L后贮存于冰箱。稀释液:取贮存液1.2 5 m L,用蒸馏水稀释至10 0 0 m L,分装于适宜容器中,1 2 1 高压灭菌1 5m i n。A.3 无菌生理盐水A.3.1 成分氯化钠 8.5g蒸馏水 10 0 0m LA.3.2 制法称取8.5g氯化钠溶于10 0 0m L蒸馏水中,1 2 1高压灭菌1 5m i n。
