1、书 书 书犐 犆犛 犅 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准犌犅犜 实验动物猴马尔堡病毒检测方法犔犪 犫 狅 狉 犪 狋 狅 狉 狔犪 狀 犻 犿犪 犾犕犲 狋 犺 狅 犱犳 狅 狉犲 狓 犪犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳狊 犻 犿 犻 犪 狀犕犪 狉 犫 狌 狉 犵狏 犻 狉 狌 狊（犕犃犚犞）发布 实施国 家 市 场 监 督 管 理 总 局国 家 标 准 化 管 理 委 员 会发 布书 书 书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准由全国实验动物标准化技术委员会（）提出并归口。本标准起草单位：海南出入境检验检疫局检验检疫技术中心、中华人民共和国福州海关、中华人民共和国成都海关、中
2、华人民共和国海口海关、中华人民共和国济南海关、北京脑科学与类脑研究中心、中华人民共和国海口海关、中华人民共和国昆明海关。本标准主要起草人：李丹丹、张体银、安微、王绥家、凌宗帅、李文龙、陈平亚、艾军。犌犅犜 实验动物猴马尔堡病毒检测方法范围本标准规定了猴马尔堡病毒实时荧光 检测的操作方法。本标准适用于猴马尔堡病毒的检测。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。分析实验室用水规格和试验方法 出入境动物检疫采样 实验室生物安全通用要求术语和定义下列术语和定义适用于本文件。
3、马尔堡病毒犕犪 狉 犫 狌 狉 犵狏 犻 狉 狌 狊一种高致病性病毒，属丝状病毒科（），单股负链病毒，基因组约 ，为已知的最大的负链病毒。逆转录实时荧光聚合酶链式反应狉 犲 犪 犾 狋 犻 犿犲狇 狌 犪 狀 狋 犻 狋 犪 狋 犻 狏 犲狉 犲 狏 犲 狉 狊 犲狋 狉 犪 狀 狊 犮 狉 犻 狆 狋 犻 狅 狀狆 狅 犾 狔犿犲 狉 犪 狊 犲犮 犺 犪 犻 狀狉 犲 犪 犮 狋 犻 狅 狀；狉 犲 犪 犾 狋 犻 犿犲犚犜 犘犆犚将逆转录为后再作为模板进行实时荧光扩增。反应体系中加入一对引物的同时加入一条特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸片段，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光
4、基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；特异性扩增时，犜犪 狇酶的 外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，实现了荧光信号的累积与产物形成完全同步。噪音狀 狅 犻 狊 犲荧光仪在仅仅使用管和水的状态下的本底荧光强度。犆 狋值犮 狔 犮 犾 犲狋 犺 狉 犲 狊 犺 狅 犾 犱狏 犪 犾 狌 犲从基线到指数增长的拐点所对应的反应循环次数。缩略语下列缩略语适用于本文件。犌犅犜 ：焦碳酸二乙酯（）：脱氧核苷三磷酸（）：羧基荧光素（）：马尔堡病毒（）：磷酸盐缓冲液（）：核糖核酸（）：逆转录聚合酶链式反应（）：十二烷基硫酸钠（）：羧基
5、四甲基若丹明（）犜犪 狇酶：犜犪 狇聚合酶（犜犪 狇 ）：三（羟甲基）氨基甲烷 （）试剂或材料本标准所用水应符合 中一级水的规格要求。裂解液：或其他等效裂解液。三氯甲烷异戊醇：体积比。异丙醇：预冷。磷酸盐缓冲液（）：见附录中的。无 水：见。乙醇：见。逆转录酶：保存，避免温度剧烈变化。缓冲液。：含、各 。：。犜犪 狇聚合酶：保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。酶抑制剂。阳性对照：体外转录的、非感染性的、猴马尔堡病毒阳性片段，序列参见附录。阴性组织对照：猴马尔堡病毒阴性组织样品。引物和探针，浓度为 ，序列如下：上游引物 ：；下游引物：；探针：。仪器设备 荧光定量核酸扩增仪。生物安全柜。电子天平。高速
6、冷冻离心机，台式离心机。冷藏冷冻冰箱。组织匀浆器。旋涡振荡器。犌犅犜 微量可调移液器：、。低温冰箱，温度。样品采集 生物安全要求样品的采集、保存及运输过程中应做好相关人员生物安全保护，并符合 的相关要求。样品的处理应在具有生物安全级条件的实验室中进行，实验室条件符合 要求。取样工具棉拭子、剪刀、镊子、离心管、一次性无菌注射器，上述取样工具应无菌。血液样品用无菌注射器直接吸取血液至 无菌抗凝离心管中，编号备用。肛拭子或者粪便将灭菌的棉拭子插入肛门或者粪便中轻轻左右搅动，然后将拭子放入装有 的离心管内，加盖、编号。棉拭子样品于旋涡振荡器上振荡混匀约后，于离心机中瞬时离心，立即使用或 备用。内脏样品
7、用无菌的剪刀和镊子剪取待检动物的肝脏、肾脏、心脏或者脾脏约 于组织匀浆器中，加入 匀浆，然后将组织悬液转入无菌 离心管中 犵离心 ，取上清液转入另一无菌 离心管中，编号备用。存放和运送采集或处理的样本在条件下保存应不超过；若长期保存，应放置 冰箱，避免反复冻融（最多冻融次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。试验步骤 实验室生物安全要求病原样本的检测应在生物安全级条件的实验室中进行，实验室条件符合 要求。样本核酸提取 在样本处理区进行。为防止降解，所用试验用具及溶液应无酶，操作过程中应佩戴一次性橡胶或乳胶手套。取 病毒液或已处理好的样品加入到无酶的 离心管中，加入
8、 试剂，用旋涡振荡器剧烈振荡 后，室温放置。加入 三氯甲烷，用旋涡振荡器剧烈振荡 后室温放置，犵离心 。吸取上清液转移至一个新的无酶的 离心管中，加入 异丙醇，上下颠倒混犌犅犜 匀，室温放置 。，犵离心 ，弃上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将液体去除。加入 预冷的 乙醇，缓慢颠倒洗涤沉淀。、犵离心 ，弃上清液，将离心管倒置于吸水纸上，室温干燥沉淀 。加入 水，溶解沉淀后，室温孵育 。提取的应在内使用或 冰箱保存备用。在实验过程中，同时设置阴性对照和以水空白对照。可采用同等效果的商业化抽提试剂盒代替以上方法。反应体系取出相应的荧光 试剂、引物探针等，在室温下融化后，犵离心。按样品数量配制反应液，
9、每个反应管包含：缓冲液，上下游引物各，探针，聚合酶，逆转录酶，酶抑制剂，水。充分混合均匀，向每个反应管中各分装，转移至样本处理区，最后加入总。实时荧光扩增可以采用等效的商品化荧光定量试剂盒。反应程序 反转录 ；预变性；变性，退火，收集荧光，共 个循环。同时设阳性对照、阴性对照和空白对照，记录 值。可根据不同仪器要求将反应程序做适当调整。结果判定 结果分析条件设定综合分析仪器给出的各项结果，基线以仪器给出的默认值作为参考，阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点为准，具体根据仪器噪音情况进行调整，选择通道进行分析。质控标准阳性对照样品有对数扩增曲线，而且 值。阴性对照和空白对照无
10、 值并且无扩增曲线。二者均成立才可判定试验成立。结果描述及判定检验样本 值，且出现典型的扩增曲线，则判定阳性。检验样本 值 时，重复一次，如果 值仍然，并且曲线有明显的对数增长期，则判定阳性；否则判定阴性。样本 值为零或 值 时，则判定阴性。犌犅犜 附录犃（规范性附录）试 剂 配 方犃 犿狅 犾犔犘犅犛 将上述成分依次溶解，去离子水定容至终体积为 ，调至，高压灭菌 ，室温保存。犃 无犚犖犪 狊 犲超纯水（犇犈犘犆水）超纯水 焦炭酸二乙酯（）室温过夜，灭菌，或直接购买无 超纯水。犃 乙醇无水乙醇 无 超纯水 现配现用。犌犅犜 附录犅（资料性附录）参 考 序 列实时荧光 扩增的猴马尔堡病毒基因序列（共 ）犌犅犜
