1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 50262017代替SN/T 20322007饲料中T-2毒素的测定酶联免疫吸附法Determination of T-2 toxin in animal feeding stuffsEnzyme-linked immunosorbent assayICS 65.120B 462017-11-07发布2018-06-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布ISN/T 50262017前 言本标准按照GB/T 1.12009及SN/T 00011995出口商品中农药、兽药残留量及生物毒素检验方法标准编写的基本规定给出的规则起草。本标准由国
2、家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。本标准主要起草人：冯民、朱臻怡、魏云计、王小晋、何健、朱亮亮、罗晓琴。1SN/T 50262017饲料中T-2毒素的测定酶联免疫吸附法1范围本标准规定了饲料中T-2毒素的酶联免疫吸附测定方法。本标准适用于出入境检验检疫工作中玉米、小麦、豆粕、棉柏等饲料原料及配合饲料和浓缩饲料中T-2毒素的初步筛选测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格
3、和试验方法GB/T 201952006动物饲料试样的制备GB/T 287182012饲料中T-2毒素的测定免疫亲和柱净化-高效液相色谱法NY/T 20712011饲料中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T-2毒素的测定液相色谱-串联质谱法3方法提要本方法的测定是基于竞争性酶联免疫反应，用甲醇/水振荡提取试样中的T-2毒素。处理后试样中的T-2毒素与T-2毒素酶结合物竞争结合至包被在微孔板上的T-2毒素偶联抗原。通过洗涤除去微孔上未结合的T-2毒素与T-2毒素酶结合物，然后加入反应底物，用酶标仪测定450 nm波长下吸光度，根据吸光度值得出试样中的T-2毒素含量。4试剂和材料4.1除另有说明外，所用试剂
4、均为分析纯，水符合GB/T 6682二级水的规定。4.2T-2毒素酶联免疫试剂盒（参见附录A）。4.3甲醇。4.4氯化钠。4.5甲醇-水提取液：用甲醇和水以11的比例配制成提取液备用。4.610%氯化钠溶液：称取10.0 g氯化钠，加入100 mL水溶解混匀。5仪器和设备5.1酶标仪：配备450 nm滤光片。5.2分析天平：感量0.01 g。5.3振荡器。5.4离心机。5.5培养箱。5.6单道微量移液器：20 L200 L，100 L1 000 L。2SN/T 502620175.7多通道微量移液器：50 L300 L。5.8容量瓶：100 mL。5.9聚苯乙烯离心管：2 mL、50 mL。6
5、试样制备与保存6.1试神制备按GB/T 201952006要求制备试样。6.2试样保存将试样于-10-20下避光保存。7分析步骤7.1提取称取5 g试样（精确到0.01 g）至50 mL聚苯乙烯离心管中，加入25 mL甲醇-水提取液（4.5），用振荡器振荡5 min，于20 25 下，3000g以上离心5 min。取500 L上清液至2 mL聚苯乙烯离心管中，加入500 L 10%氯化钠溶液（4.6），用振荡器振荡1 min，混匀，作为试样提取液待检。高浓度的样品，毒素含量如超出标准曲线范围，可进一步稀释，直至样品中毒素浓度在标准曲线范围 以内。7.2测定条件7.2.1操作条件所有操作应在20
6、25进行，T-2毒素试剂盒中所有试剂的温度均应回升至2025后方可使用。7.2.2洗板条件洗涤次数5次，每次加入水的量为250 L。7.2.3酶标仪测定条件酶标仪测定波长为450 nm。7.3测定步骤7.3.1将测定所需的微孔条插入微孔架，记录标准溶液和试样提取液在微孔架上的位置，每个标准溶液和试样提取液均做双孔测定。7.3.2根据需要量将浓缩酶结合物用酶结合物稀释液按照110的体积进行稀释，配制成酶结合物工作液，现配现用。7.3.3分别吸取20 L T-2毒素标准溶液（浓度分别为0 g/L、1 g/L、3 g/L、9 g/L、27 g/L、81 g/L）和试样提取液至对应的微孔中。7.3.4
7、吸取100 L酶结合物工作液（7.3.2）至各微孔，均匀混合，以封口膜将微孔覆盖，防止试液挥发，放置于培养箱中，于（251）避光孵育10 min。7.3.5倒出孔中液体，以250 L水反复清洗微孔，重复操作5次，以保证完全除去微孔中液体。3SN/T 502620177.3.6加入50 L底物液A液和50 L底物液B液至各微孔，放置于培养箱中，于（251）避光孵育5 min。7.3.7孵育完毕后加入50 L终止液至各微孔，充分混匀，用酶标仪测定450 nm波长处的吸光度值。8结果计算8.1计算百分吸光率用所获得的标准溶液或试样提取液吸光度值与浓度为0 g/L的标准溶液吸光度值的比值进行计算，见式
8、（1）：0100%AWA （1）式中：W 百分吸光率，%；A 标准溶液或试样提取液的平均吸光度值；A0 浓度为0 g/L的标准溶液的平均吸光度值。8.2绘制标准曲线 以计算的百分吸光率（%）为纵坐标，标准溶液浓度的对数值（log10）为横坐标绘制标准曲线。每次实验均需重新绘制标准曲线。8.3试样结果计算将试样的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出试样所对应的浓度后，试样中T-2毒素的含量按（2）式计算：2Vm （2）式中：X 试样中T-2毒素的含量，单位为微克每千克（g/kg）；C 从标准曲线上查得的试样中T-2毒素的浓度，单位为微克每升（g/L）；V 甲醇-水提取液体积，单位为毫升（m
9、L）；m 试样的称取量，单位为克（g）；f 超出标准曲线浓度范围的样品的再次稀释倍数。也可以用各种酶标仪的数据处理软件进行计算。注：所得结果保留一位小数。9确证实验如被测样品中T-2毒素含量大于限量要求，须采用GB/T 287182012或NY/T 20712011进行确证。10测定低限和回收率10.1测定低限4SN/T 50262017本方法的测定低限为10 g/kg。10.2回收率本标准方法的回收实验，以玉米、小麦、豆粕、棉粕等饲料原料及配合饲料和浓缩饲料为空白样品基质，进行3个浓度水平的添加回收实验，3个浓度包括了测定低限，测得T-2毒素的回收率范围参见附录B。5SN/T 5026201
10、7附录A（资料性附录）T-2毒素酶联免疫试剂盒1）A.1试剂盒组成A.1.1包被T-2毒素偶联抗原的微孔条，12条8孔。A.1.2T-2毒素标准溶液（浓度分别为0 g/L、1 g/L、3 g/L、9 g/L、27 g/L、81 g/L）。A.1.3浓缩酶结合物：抗T-2毒素单克隆抗体与辣根过氧化物酶的结合物。A.1.4酶结合物稀释液。A.1.5底物液A液。A.1.6底物液B液。A.1.7终止液。试剂盒应在2 8 避光条件下保存。A.2制备方法（能达到相当效果者均可）A.2.1试剂配制A.2.1.1包被缓冲液碳酸钠 1.59 g碳酸氢钠 2.93 g加水定容至1 000 mL。A.2.1.2PB
11、S 缓冲液磷酸二氢钾 0.2 g十二水合磷酸氢二钠 2.9 g氯化钠 8.0 g氯化钾 0.2 g加水定容至1 000 mL。A.2.1.3PBST缓冲液吐温-20 0.5 mL加PBS缓冲液1 000 mL。A.2.1.4封闭液蔗糖 5.0 g小牛血清 20 mL加PBS缓冲液100 mL。1）给出该信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对某一产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，需经实验评估后使用这些等效产品。6SN/T 50262017A.2.1.5酶结合物稀释液牛血清白蛋白 1.0 g叠氮化钠 1.0 g加PBS缓冲液1 000 mL。A.2.1.6底物液A液再取20 mg 3，3，
12、5，5-四甲基联苯胺（TMB），用10 mL无水乙醇溶解，充分振荡，加水定容至100 mL。A.2.1.7底物液B液一水柠檬酸 2.1 g磷酸氢二钠 2.82 g0.75%的过氧化脲 0.64 mL加水定容至100 mL。A.2.1.8终止液量取108.7 mL 98%的浓硫酸溶液，缓慢加入水中，冷却至室温后，加水定容至1 000 mL。A.2.1.9T-2毒素标准储备溶液称取10.0 mg T-2毒素标准物质，用甲醇定容至10.0 mL，配制成1.0 mg/mL的标准储备溶液。避光保存于-20 冰箱中，可使用6个月。A.2.1.10T-2毒素标准溶液浓度分别为1 g/L、3 g/L、9 g/
13、L、27 g/L、81 g/L，用T-2毒素标准储备溶液和PBS溶液配制，以PBS溶液作为浓度为0 g/L的标准溶液。A.2.2微孔条制备用包被缓冲液将T-2毒素偶联抗原稀释至20 g/mL，每孔加入100 L包被微孔条，于37避光放置2 h；将孔内液体甩干，用PBST溶液洗1次后拍干，每孔加入150 L封闭液，于37避光放置2 h，甩掉孔内液体后拍干。SN/T 50262017附录B（资料性附录）实验回收率结果表B.1实验回收率结果名称添加浓度/（g/kg）回收率范围/%变异系数范围/%T-2毒素1065.0105.05.513.05070.8107.65.211.150080.3109.35.29.2SN/T 50262017中华人民共和国出入境检验检疫开本 8801230 1/16 印张 0.75 字数 20 千字2021 年 3 月第一版 2021 年 3 月第一次印刷印数 110书号：155175442 定价 16.00 元饲料中T-2毒素的测定酶联免疫吸附法行 业 标 准SN/T 50262017*北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023）编辑部：（010）65194242-7530北京中献拓方科技发展有限公司印刷中国海关出版社有限公司出版发行网址
