1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 52792020鳗鲡疱疹病毒感染检疫技术规范Quarantine protocol for infection with Herpesvirus anguillae2020-12-30 发布2021-07-01 实施ICS 11.220CCS B 41中华人民共和国海关总署发 布SN/T 52792020I前 言本文件按照 GB/T 1.12020 的规定起草。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国厦门海关、中华人民共和国海口海关、中华人民共和国深圳海关本文件主要起草人：郭书林、吴山楠、王津津、陈信忠、丁亦男、刘荭
2、、杨俊萍、龚艳清、孔凡德。1SN/T 52792020鳗鲡疱疹病毒感染检疫技术规范1 范围本文件规定了鳗鲡疱疹病毒的 PCR 和荧光探针 PCR 检测方法。本文件适用于鳗鲡疱疹病毒感染的检疫鉴定及其流行病学调查、诊断和监测。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 18088 出入境动物检疫采样SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范3 术语、定义和缩略语本文件没有需要界
3、定的术语和定义。下列缩略语适用于本文件。HVA：鳗鲡疱疹病毒（Herpesvirus anguillae）PCR：聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction）Taq 酶：水生栖热菌 DNA 聚合酶（Thermus Aquaticus DNA Polymerase）4 HVA 感染概述鳗鲡疱疹病毒感染由鳗鲡疱疹病毒引起，该病毒的英文名称为 Herpesvirus anguillae（HVA），也作 Anguillid herpesvirus 1(AngHV1)。被感染的鳗鲡可不表现临床症状，产生的临床症状不具备典型特性。HVA 的流行病学、病原特征等参见附录 A。5 试剂
4、和材料用水若非注明，应符合 GB/T 6682 中一级水的规格。除另有规定，所用试剂均为分析纯。5.1 Taq 酶（5 U/L）：-20 保存，不要反复冻融。5.2 PCR 引物(20 mol/L)：下列 PCR 引物可以特异性扩增 HVA 的一个大小为 394 bp 的 DNA 片段。5.2.1 上游引物 HVAPOLVPSD：5-GTGTCGGGCCTTTGTGGTGA-35.2.2 下游引物 HVAPOLOOSN：5-CATGCCGGGAGTCTTTTTGAT-35.3 荧光探针 PCR 引物（10mol/L）。5.3.1 上游引物 AngHV1.CapProt.F06:5-TGCTCT
5、TGGAGTCGGTTGATG-35.3.2 下游引物 AngHV1.CapProt.R06:5-CCGTGTGGGAAAAGACTATTTGA-35.4 荧光探针PCR Taqman探针(5 mol/L)：AngHV1.CapProt.pR06:5-TCTGAAAACCCGCTCGCCCTGA-3，2SN/T 52792020其 5 端和 3 端分别标记 6-FAM 和 BHQ-1。5.5 荧光探针 PCR 反应混合液：为商业试剂，主要成分为 AmpliTaq Gold DNA Polymerase，dNTPs，实时荧光 PCR buffer。可采用同等效果的其他试剂。6 仪器和设备6.1
6、恒温水浴锅。6.2 台式冷冻高速离心机。6.3 PCR 仪。6.4 电泳仪。6.5 凝胶成像仪。6.6 荧光 PCR 仪。7 HVA 感染的诊断7.1 临床症状的诊断HVA 感染时，鳗鲡的群体间和个体间的临床症状有很大的不同，普遍存在的临床症状有胸鳍、鳃盖、鳃丝出血。临床症状还可表现为体表黏液松弛、增生，继而脱落，体表出现黏液缺损斑块。随着病情的发展，病变至真皮层，发生溃疡，穿孔并露出内脏，头部充血发红（红头），腹部皮肤出血，鳃、部分鳍条及肛门充血，烂鳃，眼突和腹胀，肝脏肿大褪色或呈红色，肾脏肿大，胆囊膨大，肠炎，持续死亡等。7.2 采样采样数量参照 GB/T 18088 和 SC/T 710
7、3 规定。可根据样品的鲜活程度，分别采用充氧、4 冷藏或冷冻等方式保存运送到实验室。7.3 取样部位7.3.1 对于体长 4 cm 的鱼体可取鳃、肝、脾、肾等部位进行检测。7.3.2 对于体长 4 cm 的鱼体，可以取整只进行检测。7.4 组织 DNA 提取7.4.1 在冰盒中通过研磨工具将组织块研磨成匀浆状，取约 25 mg 组织匀浆于 1.5 mL 离心管中，在其中加入 500 L 裂解缓冲液（见 B.1）和终浓度为 100 g/mL 的蛋白酶 K（见 B.2）。将上述离心管置于 55 水浴，孵育 1 h2 h，使组织充分裂解。加入 350 L 抽提液 1（见 B.3）充分混合后 12 0
8、00 g 离心5 min。取上层水相，加入350 L抽提液2（见B.4），充分混合后12 000 g离心5 min。取上层水相，加入 1.5 倍体积-20 预冷的无水乙醇，混匀后室温放置 10 min 后 15 000 g 离心 10 min，弃上清。瞬时离心，用移液器小心吸弃残留上清。室温放置 5 min 晾干沉淀。加入 10 L 灭菌双蒸水，轻弹管壁使沉淀溶解，即可用作 PCR 模板。7.4.2 组织 DNA 提取也可以采用等效的商品化 DNA 提取试剂盒，根据说明书使用。3SN/T 527920207.5 PCR 检测及结果判定7.5.1 PCR 扩增体系10PCR 缓 冲 液（见 B.
9、5）5 L，20 moL/L PCR 引 物（5.2）各 1 L，25 mmol/L MgCl2 5 L，10 mmoL/L dNTPs 1 L，5 U/L Taq 酶（5.1）1 L，DNA 模板 5 L，加双蒸水至总体积 50 L。7.5.2 PCR 扩增条件反应条件为94 预热5 min，然后94 变性40 s，65 退火45 s，72 延伸60 s，共40个循环，最后 72 延伸 10 min，4 保存。PCR 反应条件也可根据商业化 Taq 酶的说明书设定。7.5.3 设立对照取已经由 PCR 确诊为阳性的鳗鲡组织样本核酸提取物作为阳性对照模板。取已经由 PCR 确诊为阴性的鳗鲡组织
10、样本核酸提取物作为阴性对照模板。空白对照为无菌去离子水。7.5.4 琼脂糖凝胶电泳用 TBE 电泳缓冲液（见 B.6）配制 1.5%的琼脂糖凝胶平板（含 0.5 g/mL EB），约 0.5 cm 厚。将6 L 样品和 2 L 上样缓冲液（见 B.7）混合后加入样品孔，设立 DNA 标准 Marker 作对照。30 mA 电泳约 0.5 h，当溴酚蓝指示剂到达凝胶平板底部时停止。凝胶成像仪下观察核酸带。7.5.5 结果判定7.5.5.1 当阳性对照在大约 394 bp 位置出现单一的核酸条带，阴性对照没有该核酸条带，实验结果成立。7.5.5.2 样品在大约 394 bp 位置出现核酸条带者，取
11、 PCR 扩增产物测序，测序序列在 Genbank 中进行序列同源性比较，同源性为 95%以上的可判为 HVA 核酸阳性。参考序列 Genbank 序列登录号为：KX027736.1，参考序列参见附录 C。7.5.5.3 无扩增带、扩增带的大小不是 394 bp、测序结果与参考序列的同源性低于 95%的样品可判定为 HVA 核酸阴性。7.6 荧光探针 PCR 检测及结果判定7.6.1 荧光探针 PCR 扩增体系在 0.2 mL PCR 薄壁管或八连管中，每个反应体系加入 2 荧光探针 PCR 反应混合液（5.5）10 L，10 moL/L 的荧光探针 PCR 引物（5.3）各 0.4 L，5
12、moL/L 的荧光探针 PCR Taqman 探针（5.4）0.3L，DNA 模板 5 L，加入灭菌双蒸水至终体积为 20 L。7.6.2 荧光探针 PCR 扩增条件反应条件为 95 预热 10 min，然后 95 变性 15 s，60 30 s，40 个循环，每个循环结束采集FAM 通道荧光信号。7.6.3 设立对照按 7.5.3 设阴性对照、阳性对照和空白对照。4SN/T 527920207.6.4 结果判定7.6.4.1 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点为准。7.6.4.2 空白对照和阴性对照无 Ct 值，阳性对照出现典型的阳性扩增曲线，且 Ct 值小于 30，实
13、验有效。7.6.4.3 若检测样品 Ct 值 38，则判为 HVA 核酸阴性。若检测样品 Ct 值 35，且出现典型扩增曲线，则判为 HVA 核酸阳性。若检测样品的 35 Ct 值 38，则判为结果可疑,需再重复进行荧光探针 PCR 检测，结果依然可疑，则判为阳性。8 综合判定8.1 临床症状只能作为初步诊断的参考，应进一步采用 PCR 方法进行确诊。8.2 经 PCR 检测扩增出目的大小的 DNA 片段，应通过核酸序列测定，并与标准参考序列（参见附录 C）比对进行确诊。8.3 对荧光探针 PCR 检测阳性和可疑的样本，应进一步采用 PCR 方法进行确诊。5SN/T 52792020附 录 A
14、（资料性）鳗鲡疱疹病毒感染概述A.1 病原鳗鲡疱疹病毒（Herpesvirus Anguillae，简称 HVA）属疱疹病毒目（Herpesvirales），异疱疹病毒科（Alloherpesviridae），鲤疱疹病毒属（Cyprinivirus）的一种大型双链 DNA 病毒，该病毒具有二十面体核衣壳。核衣壳外覆盖一层核被膜，最外层为源自宿主的直径约为 200 nm 的囊膜。该病毒基因组大小约为 249 Kb。A.2 易感动物除鳗鲡，研究证实银鲫(Carassius gibelio)、鲈(Perca fluviatilis)、白梭吻鲈(Sander lucioperca)，小体鲟(Acipe
15、nser ruthenus)和虾虎鱼(Neogobius melanostomus)等多种鱼类是鳗鲡疱疹病毒的带毒者。A.3 临床症状感染发生时鳗鲡的群体间和个体间的临床症状有很大的不同，普遍存在的临床症状有头部、胸鳍、鳃盖、鳃丝的出血；体表黏液松弛、增生，继而脱落，形成黏液缺损斑块；鳃部溃烂。病情程度严重时，病变可至真皮层，发生溃疡，穿孔并露出内脏；肝脏肿大褪色或呈红色，肾脏肿大，胆囊膨大，肠炎；发病鱼体持续死亡。6SN/T 52792020附 录 B（规范性）试剂配制B.1 裂解缓冲液10 mmol/L Tris-Cl（pH 值 8.0），0.1 mol/L EDTA（pH 值 8.0），
16、0.5%（质量浓度）SDS，4 保存。B.2 蛋白酶 K1TNE 缓冲液 10 mL10 mg/mL 蛋白酶 K 原液 0.1 mL将 100 mg 蛋白酶 K 加入 10 mL 双蒸水中溶解，配制成 10 mg/mL 的原液，并在-20 保存备用，使用时再配制成 100 g/mL 的工作液。B.3 抽提液 1将 1.0 moL/L pH 值 7.9 Tris 饱和酚、三氯甲烷、异戊醇按 25241 的比例混合，避光保存。B.4 抽提液 2将三氯甲烷和异戊醇按 241 的比例混合，避光保存。B.5 10PCR 缓冲液KCl 500 mmol/LTrisCl（pH 值 8.3，室温）100 mmol/LMgCl2 15 mmol/L明胶 0.1%B.6 TBE 电泳缓冲液Tris 54.0 g硼酸 27.5 g EDTA 2.9 g先加适量蒸馏水，完全溶解后用蒸馏水定容至 1 000 mL。用 5 mol/L 的盐酸调到 pH 值 8.0。B.7 上样缓冲液每 100 mL 溶液中含：溴酚蓝 0.25 g，蔗糖 40 g。SN/T 52792020附 录 C（资料性）PCR 扩增产物的参
