1、G B/T 5 4 1 3-1 7-1 9 9 7前言 木标准给出两种方法，方法一是微生物法.为等效采用美国公职分析化学师协会(AO A C)的方法，虽然操作步骤萦杂，但测定结果准确度高.方法二是高压液相色谱法，是经实验确定的一种快速、准确的方法。木标准方法一为仲裁法。木系A标准从实施之日 起，代替G B 5 4 1 3-8 5.木标准由中国轻工总会提出。木标准由全国乳品标准化中心归口。木标准负责起草单位:国家乳制品质量监督检验中心。木标准参加起草单位:卫生部食品卫生监督检验所、浙江省轻工业研究所、哈尔滨森永乳品有限公司、雀粱(中国)投资服务有限公司。木标准 主 要起 草人:张 玉杰、工 芸、
2、殷晓 红、杨 金宝、吕为群。中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准婴 幼 儿 配 方 食 品 和 乳 粉G B/T 5 4 1 3.1 7-1 9 9 7泛 酸 的 测 定代 替 G B 5 4 1 3-8 5Mi l k p o v Me r a n d f o r m u l a f o o d s f o r i n f a n t a n d y o u n g c h il d r e n D e te r min a t io n o f p a n t o t h e n ic a c id范 围木标准规定了用微生物法和高压液相色谱法测定泛酸的方法。木标准方法一适用于婴幼儿配
3、方食品和乳粉中泛酸的测定，方法二适用于乳粉中泛酸的测定。方 法一 微生 物法2 方 法原理 利用植物乳杆菌(L a c t o b a c i li u s p l a n ta r u m)的繁V i a与样品中的泛酸含址成正比的关系可计算出样品中的泛敌含a.3 试剂、菌种和培养基 所有试剂，如末注明规格，均指分析纯，所有实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。3.1 生理盐水:她氯化钠溶于1 0 0 O.L容址瓶中。东2 泛 酸钙:标准 品。3.3 乙酸:c(H A c)为0.2.i/L.吸1 2 m L冰乙酸用燕馏水稀释至I L.3.4甲苯。3.5 乙酸钠:c(N&A c)为0.2 m
4、0 i/L.溶解1 6.4 g无水乙酸钠于水中，稀释至1 0 0 O.L.&6 菌种植物乳杆菌(Ud u b a c iU n s p la n t a、二).忍7 培 养基&7.1 乳酸杆菌琼脂培养基:光解陈1 5 g,醉母浸青5 9,葡萄械l o g,番茄汁 1 0 0 m L.磷酸二氧钾2 9,聚 h 梨糖单A酸酷18，琼脂I 飞，加燕馏水至1 0 0 0 m L,p H 6.8 士0.2(2 5 1C).&7.2 乳酸杆菌肉汤培养基:光解陈I 宛.解母浸青宛，荀萄翻.飞，番茄汁 1 0 0.1.,磷酸二氧钾飞，聚山梨糖单油ff i ffl i Il l,加燕馏水至1 0 0 0,n L
5、,p H6.8 土0.2(2 5 C).忍7.3 泛酸测定用培养墓:荀萄械4 飞，乙敌钠2 飞，无维生素酸水解酪蛋白I 飞，磷酸牡二钾 I ll,磷酸二氧钾1 9,L-KU酸0.4 9,L 一 色氨酸0.l g,%酸镁0.4 g,氮化钠2 0.g,硫酸q p.铁2 0.g,硫酸锰2 0.g,硫酸腺嗓岭2 0.g,盐酸鸟嗦吟2 0 m g,尿喃咤2 0.g，胡萝卜 索4 0 0 p g,盐酸硫胺素2 0 Q,g，生物素0.8 p g,p-氨基苯甲酸2 0 0 p g,烟酸l m g,盐酸毗哆醉8 0 0 g,聚山梨抽单油酸M 0.I g,加燕馏水至1 0 0 0,n L,P H 6.7士0.1(
6、2 5 r).国家 技术监 普 局 1 9 9 7-0 5-2 8 批准1 9 9 8-0 9-0 1 实施G B/T 5 4 1 1 1 7-1 9 9 74 仪 器 常用实验室仪器及分光光度计。5 制 备5.1 菌种的制备5.1.1 将保存在直柱状th l 体培养基中的植物乳杆菌接种到新的乳酸杆菌琼脂培养基中，培养后再继代培养一次，然后将其转接到乳酸杆菌肉汤培养基中培养后备用。5.1.2 将5.1.1 中的菌怂液以2 0 O O r/min离心2-3 min,倾出上济液，加入】O.L生理盐水(3.1),搅匀，再离心2-3 m in,如此清洗3 次.吸1.O m L该菌悬液于I (h n L
7、生理盐水(3.1)中。5.1.3 用7 2 1 型分光光度计，于5 5 0 n m波长下.以生理盐水(3.1)做对照，侧5.1.2菌悬液的浊度值，此值应在6 0%-8 0%之间。52 标准滚液的制备5.2.1 泛酸标准贮备液:浓度4 印9 加L.精确称取4 5-5 5.g 泛酸钙标准品(3.2),溶入5 0 0 m L燕馏水中，加l o mL乙酸(3.3)，加I O o m L乙酸钠(3.5)洲 水稀释至泛酸钙精确浓度为4 3.4 7 p g/mL(即泛酸浓度为4 C ,g/m L)，加甲笨(3.4)t .于冰栩中。5.2.2 泛酸中间贮备液:浓度 Ig g 腼L.取2 5 mL标准贮备液(5
8、.2.1),加入大约5 0 0 M L燕馏水，乙酸I O m L(3.3)，乙酸钠I O O mL(3.5),再用水 稀释 至 I L.加 甲笨(3.4)r-于冰 箱中。5.2.3 泛酸标准工作液:高浓度的为l O n g/m L,低浓度的为5.g/m L.吸5.O mL中间贮备液(5.2.2),用燕馏水稀至5 0 0,O mL.侮次测定前制备。吸5.O L中间贮备液(5.2.2),用燕馏水稀至 1 0 0 0 m L.每次测定前制备。6 测 定6.1 样品的处理 称取一定量的样品，加入I O M L缓冲液(称2 4.2 g T r i B.溶入2 0 0 m L水中即可)，再加足量的水，1
9、2 1 水解1 5 m i n,冷却，调P H至5.然后定容到2 5 0.L，过滤，吸4 mL滤液，稀释至泛酸的浓度约为5 n g/mL,待用.已2 标准曲线的制备 按表I 顺序加燕馏水、标准溶液和泛酸测定用培养墓于培养管中，一式三份.表 I6.3i4 It No.1 2 3 4 6 6 1 7W*ML 5 6 4 3 2 1 00 0 1 2 3 45 5 5 5 5 51)试管 N o.3-7 中 加低浓 度标准工 作液,N o.8-1 0 中加 高浓度 标准工作 液。测定液样品按表2 顺序加燕馏水、样品溶液和泛酸测定用培养墓于培养管内，一式三份。G H 汀5 4 1 S.1 7-1 9
10、9 7表 26.4 接 种 将6.2 和6.3 中所有的试管于1 2 1 杀菌5 min,然后迅速冷却。将5.1.2 中的菌怂液用毛细滴管向上述试管内各加一滴 其中标准溶液中试管N o l 除外)，混匀，3 7 士0.5 C 培养1 9-2 0 h.6.5 测定 以接种空白管做对照，测最高浓度标准样管的透光率，2 h后承新读数，二 次结果透光率2 肠，则取出全 部检验 管 测其透 光串，并记 录。了 计 算 以标样泛酸含量作横坐标，透光率为纵坐标作下作曲 线。报据样品测得的透光率，从标准曲线中查得泛酸含最的平均值，再根据式 I)计算:tf.,P I V A W-g/lo og -4-g/lo
11、o-w 景 x 赢 x 1 00 .(I )式中:2 从曲线中查得样品中泛酸的平均含星,9 9;尸 稀释!月子.样品的质IV或体积),9(或n I L).8 允许 差 同一样品两次测定值之差不得超过两次测定平均值的1 0 沁。方法二 高压液相色谱法9 方 法提要 样品经水提取，过滤，除去蛋白质后，川高压液相色谱侧定滤液中泛酸梭基的紫外吸收。1 0试剂 所有试剂，如未注明规格，均指分析纯，所有实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。1 0.1 硅酬树脂:食品添加剂。1 0.2 A lW oM C D为 0.l mo l/L.1 0.3 硫酸锌 e M s o.)为I 殆八.1 0.4 乙月 青:
12、光谱纯。1 0.5 磷敌二氧钾.c(K H.P O,)为0.0 2 in o l压。称取2.7 2 g磷酸二氧钾，加水溶解成 I G O O.L.1 0.6 乙A m-O.0 2 m.压 磷敌二氛钾溶液:体积比I 9。向I 体积乙脂中加入9 体积的0.0 2 m o l 九 磷酸二氧钾，用盐酸A节p H为3.1 1仪器 常用实验室仪器及:1 1.1 离心机.3G B/T 5 4 1 1 1 7-1 9 9 71 1.2 滤膜过滤器:滤膜 1.加m。1 1.3 五氧化二磷 操器。1 1.4 高压液相色谱仪:带萦外检测器。1 2 操作步01 2.1 样品溶液的制备1 2.1.1 准确称取样品约 I
13、 飞，加6 o m L水和I 滴硅酮树脂(1 0.1)后，转入离心管中.用盐酸湃液(1 0.2)调节P H为4-5，加入I O M L硫酸锌溶液(1 0.3)充分混合，离心分离.1 2-1.2 上清液用滤纸过滤，用I O O ML容量瓶收集滤液，离心管中残济用少量水冲洗于同一滤纸上.用少最水洗滤纸，洗液与滤液合并，加水至I 0 0 n L。经滤膜过滤器(1 1.2)过滤后作为样品溶液。1 2.2 标准溶液的制备1 2-2.1 泛酸标准贮备液:浓度为l m g/m L.准确称取在I W!M(l 1.3)中I wo的泛酸钙1.()9 1 8 g，加水溶解成1 0 0 0 mL.1 2-2.2 泛酸
14、标准工作液 准确吸取标准r.备液(1 2.2.1)1,2,4,8,1 2 r n L，分网加水成I 0 0 mL，作为标准T作液.泛酸浓度分训为1 0,2 0,4 0,8 0,1 2 印9 加L.1 2.3 测定条件 坑充剂:化学结合型硬脂硅烷。色谱柱:内径6.2-，长2 5 c m.洗脱液:乙月 条0.0 2 r n o l/L磷酸二氛钾(I 9).流速,I m L/min.测定波长:2 0 0 n m.注 1 柱的内 径和长 度可自由 选择。2 洗脱液 组成比和 流速 可报据色 通住情 况面改 变，没有统 一规定。泛酸的 保角时间 可设定 为 8-1 2 m tn.3 泛酸的 最大吸收 在
15、波 长 1 9 4-附近。但是 移动扣 在此处也 有吸 收。所 以洲定 波长定为2 0 0-.1 2.4 标准曲线 分别吸取 I O P L标准工作液(1 2.2.2)，注入高压液相色谱中.根据峰高绘制标准曲线.注:进 样a,灵敏 度与高 压液相色瀚 的注入 方式有 关，因 此达 样盆可在3-2 0 0 L之间 变动。1 2.5 样品测定 准确吸取样品溶液(1 2.01 印L.注入高乐液相色谱仪中，将所得峰高从标准曲线中求出样品滚液中泛酸的浓度。1 3分析结 果 的表 述样 品 中 泛 酸 含 二、/I、一 10 0 1产 x 1 00 ”“”“:(2)式中:，样品溶液中泛酸的质rp.浓度,p g/l O N s 二 称取样品的质量.泛酸钙含0.(Mg/k g)=a酸含V.(.n g/l 0 0 g)X 1.0 8 7泛酸钠含量(.g 八幼=泛酸含址(m g/l o 飞)XI.1 0 01 4允许 差 同一样 品 的两 次测 定值之 差不 得超 过两 次测 定平均 值的 l o%.
