1、SN中华人民共和国进出口商品检验行业标准s N 0 1 6 9 一 9 2出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法Me t h o d f o r e x a mi n a t i o n o f c o l i f o r m,f e c a l c o l i f o r m a n d e s c h e r i c h i a c o l i i n f o o d f o r e x p o r t1 9 9 2 一 1 2 一 2 8 发布1 9 9 3 一 0 5 一 0 1 实施中华人民共和国国家进出口 商品检验局 发布中华人民共和国进出口商品检验行业标准出口食品中大肠
2、菌群、粪大肠菌群 和大肠杆菌检验方法s N 0 1 6 9 一9 2代替 z 8 x0 9 0 0 2-8 6M e t h o d f o r e x a m i n a t i o n o f c o l i f o r m.f e c a l c o l i f o r ma n d e s c h e r i c h i a c o l i i n f o o d f o r e x p o r t主题 内容与适用范围本标准规定了出口 食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。本标准适用干出口食品的检验。设备和材 料;.1 吸管:l ml-，具0.1 mL刻度;5 mL和 l O
3、 mL，具 1 m L刻度。二.2 水浴箱:4 4.5 土。.5 C,23 培养箱:3 6 士1 C,4 4.5 士0.5 C.2.4 冰箱:0-5 和一1 5 一2 0 C。2.5 均质器。26 乳钵和研棒。2.7 平皿:直径 9 0 mm,2,8 天平:感量。.1 g,2.9 显微镜。2.1 0 稀释瓶:1 O O rnL,2 0 0 mL和 5 0 0 mL三角烧瓶及广口瓶。2.1 1 玻璃珠:直径约 5 mm e2,1 2 菌落计数器。培养荃及试剂月 桂基硫酸盐胰蛋白 舫(L S T)肉 汤。煌绿乳糖胆盐(B GI.B)肉汤。E C肉汤。伊红美蓝琼脂(E MB),营养琼脂斜面。色氨酸肉
4、汤MR-V P培养基。K o r s e r 氏 拘椽酸盐肉 汤。结晶紫中性红胆盐琼脂(V RB A),B u t t e r f i e ld 氏磷酸盐缓冲稀释液。生理盐水.3妇3233到35挑373839:，中华人民共和国国家进出口商品检验局1 9 9 2-1 2-2 8 批准1 9 9 3 一 0 5 一 0 1 实施S N 016 9一 9 2革兰氏染色液。K o v a c s 氏靛基质试剂。甲荃红指示剂。V o g e s-p r o s k a u e r(V-P)试剂。月乙qJ月月户卜口月.J.月.j.，勺Jl曰IJ，J4 样品制备4 门 以无菌 操作取有代表性的样品。如有包装
5、则用7 5%乙醇在开口处 擦拭后取祥。若不能 及时检验，应将冷冻样品税于一1 5 保存;非冷冻而易腐的食品，应置于 4 C 冰箱保存。检验前冷冻样品可于 2-5 C 1 8 h内解冻，或在4 5 以下 1 5 m i n内解冻。4.2 不同食品样品匀液的制备4.2 门液体食品 以灭菌吸管取样2 5 mL放入装有 2 2 5 m1稀释剂的灭菌玻璃瓶(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，以3 0 c m幅度、于 7 s内振摇 2 5 次(或以机械振荡器振摇)，制成1:1 0 的样品匀液。4.2.2 固体1 4 t 半固体食品 以无菌操作取 2 5 g 样品，放入装有 2 2 5 m 1 _ 稀释剂的灭菌均
6、质杯内，干3 0 0 0 r/m i n 均质 1-2 mi n，制成1-1 0 样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。3 稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计，用稀释剂将徉品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释，如 1 0-.1 0-3.1 0-。从制备徉品匀液至稀释完毕 全过程不得超过 1 5 mi n.大肠茵群 的测定本液55.1 大肠菌群MP N值的测定5-1.1 对每个样品，选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白脉(L S T)肉汤，每管接种 1 mL.5.1.2 将接种管置于 3 6 士1 培养 4 8 士2 h,5.1.3 观察试管的产气 情况
7、:检查倒管内 是否有气泡产生，记录在2 4 h T a 4 8 h 内产气的L S T肉 汤管数。如所有 L S T肉汤管均未产气，则可报告为大肠菌群阴性;如有产气者，则进一步作证实试验。5.2 大肠菌群的证实试验5.2.1 将所有产气管用直径为3 mm的接种环移种到煌绿乳糖胆盐(B G L B)肉汤管中。5.2.2 蹬B G L B肉汤管于 3 6 士1 C培养 4 8 士2 h,5.2.3 记录所有 B GL B肉汤管的产气管数。5-2-4 结果报告:按 B G L B肉汤产气管数，查 MP N表 见附录 B(补充件)报告每克(毫升)样品中大肠菌群的MP N值。6 粪大肠菌群测定6.1 用
8、直 径为3 m m的 接种环将所有4 8 士 2 h内 产气的L S T肉 汤管培养物移 种于E C肉 汤管中。6.2 将所有接 种的E C肉汤管在3 0 m i n 内放入 带盖4 4.5 1 0.5 水浴箱内，培养2 4 士 2 h 水 浴箱的 水平面应高于肉汤培养基液面。应以已知为4 4.5 产气阳性的大肠杆菌和4 4.5 C不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。6.3 记录E C肉 汤管的产气情况。产气管为粪大肠菌群试验阳 性;不产气管为 粪大肠 菌群试 验阴 性。6.4 结果报告;按产气管数，查M P N表报告每克(毫升)样品中 粪大肠菌4 的MP 值。了 大肠杆菌测
9、定7.1 将6.3 条中的E C肉 汤管继续培养2 4 h，取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(E M B)平板，s x 0 1 6 9 一9 23 6 士I C培养2 4 士2 h,7.2 检查 平板上有无 具黑色中 心有光泽或无 光泽的 典型菌落。7.3 如有 典型菌落，则从每个平 板上至少挑取2 个典型菌落;如无典型菌落，则 从每个平板上至少挑取2 个可疑菌落.用接种针接触菌落中心 部位.移种到营养 琼脂斜面上，3 6 士1 培养1 8-2 4 h,7.4 将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。7.4.1 一 色氨酸肉汤:在3 6 士1 培养2 4 士2 h 后，加K o v a
10、 c s 氏 试剂。2-0.3 m L，上层出现红色为靛基质阳性反应。7.4.2 MR-V P培养基:在 3 6 士1 培养4 8 士2 h。以无菌操作移取培养物 1 mL至 1 3 mm X 1 0 0 m m试管中，加5%。一 蔡酚乙醇溶液0.6 m L,4 0%氢氧化钾溶液 0.2 mL和少许肌酸结晶，振摇试管后静置 2 h，如出现伊红色，为 V P试验阳性.将MR-VP培养物的剩余部分再培养4 8 h滴加5 滴甲基红溶液。如培养物变红色，为甲基红试验阳性，若变黄色则为阴性反应。7.4.3 K o s e r 氏拘椽酸盐肉汤:于3 6 士1 C 培养9 6 h记录有无生长。7.4.4 L
11、 S T肉汤:于3 6 士1 培养4 8 士2 h，观察试管中是否产气。7.4.5 革兰氏染色:取 1 8 h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴性。7.4.6 大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下:靛基质M RV P拘 椽 酸 盐鉴定(型别)+十典型大肠杆菌非典型大肠杆菌十+十主典型中间型非典型中间型+十典型产气肠杆菌非典型产气肠杆菌 如出现上表以外的生化反应类型，表明培养物可能不纯。应重新划线分离.必要时做重复试验。7.5 结果 报告:大肠杆菌为革兰氏阴性无芽抱杆菌，发酵乳糖产酸产气，I M V i C 试验为+一一或一+一一，再根据 L S T肉汤阳性管数查MP N表，报告每克
12、(毫升)样品中大肠杆菌MP N值8 大肠菌群固体培养蓦测定法8.1 样品制备同第4章。8.2 计数8-2.1 选取适宜的三个连续稀释度的样 品液，每个 稀释度接种两个灭菌平皿.每 皿1 m L。另取1 m L 稀释剂加入一个灭菌平皿中，作空白对照。8.2.2 将冷至4 5 士。.5 的结晶紫中性红胆盐琼脂(V R B A)1。一1 5 mL倾注于每个平皿中。小心旋转平皿。将培养基与样液充分混匀。B-2.3 待琼 脂凝固后，再加3-4 m L V R B A覆 盖平板表层。8.2.4 翻转平板，置于 3 6 士1 培养1 8-2 4 h,8.2.5 选用有3 0 -1 5 0 个菌 落的平板，计
13、数平板上出现的典型大 肠菌群菌落。典型菌 落为紫红色，菌落周围 有红色的胆盐沉淀环。菌落直径为0.5 m m或 更大。8.2.6 证实8.2.6.1 从V R B A平板上挑取1 0 个不同 类型的典型和可 疑菌落，移种于B G L B肉汤管内，3 6 士1 培S N 01 69 一 9 2养2 4 h 和4 8 h.观察产气情况。8.2-6.2 将出现产气的肉汤管判为大肠菌群阳性。对形成菌膜的阳性管，应进行革兰氏染色，以便排除革兰氏阳性杆菌。8.2.7 结果报告 经最后证实为阳性(产气，革兰氏阴性杆菌)的试管百分比乘以于 8.2.5 条中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每克(毫升)样品
14、中大肠菌群数。例:1 0-样品稀释液 1 mL，在 V R B A平板上有 1 0 0 个典型和可疑菌落，挑取其中 1 0 个接种 B G L B肉汤管，证实有 6 个阳性管，则该样品的大肠菌群数为:1 0 O X 6/1 0 X 1 0 /g(m L)=6.O X 1 0 /g(m L)S x 01 69一 9 2 附录A培 养 基 和 试 荆 (补充件)A l 月桂荃硫酸盐胰蛋白际(L S T)肉汤 胰蛋白肪或胰酪陈(T r y p t i c a s e)2 0 g 氯化 钠5.O g 乳糖5.。9 磷酸氢二钾(K2 H P 04)2.7 5 g 磷酸二氢钾(KH 2 P O4)2.7
15、5 g 月佳基硫酸钠0.i g 蒸馏水1 0 0 0.O m L 将各成分溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发酵管的2 0 m m X 1 5 0 m m试管中，每 管1 0 m L,1 2 1 高压灭菌 1 5 m i n。最终p H6.8 士0.2.A 2 煌绿乳枯胆盐(B L A B)肉汤 蛋白 陈1 0.O g 乳搪1 0.O g 牛胆粉(o x g a l l 或o x b i l e)溶液2 0 0.O m L 0.1 写煌绿水溶液1 3.3 m L 蒸馏水 将蛋白 陈乳糖溶于约5 0 0 m L 蒸馏水中，加入牛胆粉溶液2 0 0 m L(将2 0.O g 脱水牛胆粉溶于2 0 0 m
16、 L蒸馏水中，p H 7.0-7.5)，用蒸馏水稀释到 9 7 5 mL,调p H 7.4。再加入。.1 0 0 煌绿水溶液1 3.3 mL，用蒸馏水补足到 1 0 0 O mL，用棉花过滤后，分装到 2 4 mm X 1 5 0 mm试管(管内有倒立的小发酵管)中，每管l O mL,1 2 1 C高压灭菌 1 5 min。最终 p H7.2 10.1,A 3 E C肉汤 胰蛋白脉或胰酪际2 0.0 g 3 号胆盐或混合胆盐L 5 g 乳糖5.。9 磷酸氢二钾(K 2 H P 04)4.0 g 磷酸二氢钾(K H 2 P 0 4)1.5 g 氯化 钠5.。9 蒸馏水1 0 0 0.O mL 将以 上成分溶解于蒸馏水中，分装 1 6 m m X 1 5 0 m m试管(管内有倒立的小发酵管)，每管 8 m L,1 2 1 C 高压灭菌 1 5 min，最终p H6.9 士0.1.A 4 伊红美蓝琼脂(E MB)蛋白陈1 0.O g 乳糖1 0.O g 磷酸氢二钾(K2 H P O,)2.0 gS N 0 1 6 9 一9 2 琼脂1 5.O g 伊红7(水溶性)0.4 g 或2%水溶液2
