1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准?传染性鲑鱼贫血病检疫技术规范?发布?实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准是参照世界动物卫生组织（）水生动物疾病诊断手册）（版）中第 章的有关内容，同时依据国外在该领域取得的研究成果的基础上制定而成。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局和中华人民共和国沈阳出入境检验检疫局。本标准主要起草人：孔繁德、徐淑菲、刘荭、高隆英、林颖、陈信忠、龚艳清。犛 犖犜 传染性鲑鱼贫血病检疫技术规范范围本标准规定了用于检测
2、传染性鲑鱼贫血病的临床诊断、病毒分离、间接荧光抗体试验、方法和荧光定量 等方法。本标准适用于传染性鲑鱼贫血病的流行病学调查、监测、诊断和出入境检验检疫。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。分析实验室用水规格和试验方法缩略语下列缩略语适用于本文件。（）：大西洋鲑肾细胞系 （）：大鳞大麻哈鱼鱼胚细胞系 （）：细胞病理变化 （，）：三亚乙基二胺，又名，二氮杂二环辛烷 （）：焦碳酸二乙酯（）：溴化乙锭 （）：异硫氰酸荧光素 （）：间接荧光抗体试验 （）：传染性鲑鱼贫血病
3、 逆转录酶（）：分离自莫洛尼氏鼠白血病病毒 （）：大西洋鲑前肾细胞系试剂和材料 标准毒株、单克隆抗体、兔抗 抗体、荧光标记的羊抗鼠 、荧光标记的羊抗兔 、细胞系（、或 细胞）；由国家质量监督检验检疫总局指定实验室提供。水：试剂配制（见附录）用水应符合 中一级水的规格。犜 犪 狇 聚合酶。：含 、各 。逆转录酶。：酶抑制剂。引物：所选取的基因为 的第片段。合成的引物采用无 酶、无 酶的超纯水将引物与探针配制成 储存液，置 或更低温度冻存；使用时取适量配制成 工作犛 犖犜 液，避免多次冻融。普通 ：引物浓度为 ，扩增产物大小为 。引物序列如下：上游引物：下游引物：荧光定量 ：引物和探针浓度为 ，扩
4、增产物大小为 。引物和探针序列如下：上游引物：下游引物：探针：异丙醇：分析纯，使用前预冷到。无水乙醇：分析纯，使用前预冷到。标准分子量 ：推荐使用 。仪器和设备 电动匀浆器。倒置显微镜。荧光显微镜。冷冻切片机。高速冷冻离心机。电泳仪。扩增仪。荧光定量扩增仪。紫外观察灯或凝胶成像仪。以临床和病理变化为基础的诊断 肉眼观察行为和病理变化肉眼观察行为和病理变化如下：）腮（腮部血液瘀积除外）：外观苍白，贫血的结果，这是最突出的外部症状；）眼球突出，眼窝前部充血；）有时皮肤出血，尤其是腹部皮肤，以及小范围的水肿；）腹部膨胀，腹腔出现微黄色或淡血色液体，即腹水，腹膜有小出血点，这是早期出现的症状，较为普遍
5、；）鱼鳔出现水肿；）肝脏发黑（黑肝）：不要求每条鱼都是黑肝，但应有一些病鱼出现此症状。可能有些病鱼肝脏变黄，并有出血点；有些变的苍白，表面出现细的纤维层；）脾脏：脾呈深红色，肿大，边缘呈圆形，这是早期出现的症状，较为普遍；）肾脏：肿胀，深红色，切口处有血液和液体流出；）心脏苍白；）内脏普遍出现脂肪瘀斑；）有时出现前肠变黑；）骨骼肌有微小的出血点；犛 犖犜 ）一般来说，自然感染 的大西洋鲑鱼表现为昏睡，可能会紧紧靠在围栏处。上述所有这些变化都是 的典型症状，虽然有些症状随病情的严重性有所不同，但观察到这些症状越多，则对该病的诊断越可靠。黑肝是该病最基本的症状，也是 最特别的症状。心肌病综合症（）
6、也会出现黑肝，但它与 的区别是 会出现心脏组织的损伤。此外，在 感染和所谓“冬季溃疡症”中能观察到肝发白以及无出血性坏死。其他资料参见附录。病理组织学变化感染 的鱼可能表现为一系列病理变化，根据感染剂量、毒株、温度、年龄及免疫情况，可以表现为从没有病理症状到急性病理变化。外表损伤不能确诊为 ，但是 常出现贫血及循环紊乱。主要出现以下典型的组织病理变化：）肝脏弥漫性的出血、坏死，最后融合成带状，只剩下大静脉周围的部分未受损害（病程发展后期）；）肝窦状小管扩张、充血，甚至坏死（早期阶段），窦状小管内皮破裂，并有红细胞浸润；）带有嗜伊红细胞脱落（渗出）和窦状小管从轻微多点出血到弥漫性广泛性出血并形成
7、空隙的急性肾小管坏死和（或）细胞间隙出血为特征的肾损伤；）在脾中可以看到窦状小管中度到严重充血以及嗜红细胞现象，有吞噬红细胞作用。在疾病发展的早期阶段，红细胞比容值为 ，当红细胞比容值在 以下时，就可看到 典型的肝脏变化。而的肝脏变化（一般没有内皮破裂）虽然与 无法区别，但通常在病程的后期阶段才出现。以春季多发，刚感染 到暴发前的数月，死亡率较低，直至大暴发。通过尸体解剖和大量病死鱼检查不难作出诊断。当大量鱼出现黑肝病变时，应首先怀疑 。临床血液学变化典型血液学变化包括：红细胞比容值低于（在疾病发展的早期，红细胞比容值为 ）时，应该调查大西洋鲑鱼的 感染情况。血涂片可见退化和空泡化的红细胞，且
8、红细胞核呈不规则状。白细胞对红细胞的比例减少，尤其是淋巴细胞和血小板。除了一些表明肝脏损害的酶和电解质（深海鱼）外，还有好几种血浆成分发生减少；红细胞比容计值低于 并非只在 感染才出现，患溃疡和患红细胞包涵体综合征（）的鱼，其红细胞比容值也会低于。病毒分离 采样无菌操作，采集待检鱼的脾、心、肝，最好是有临床症状的鱼肾，作为病毒分离的材料。组织样品处理无菌操作，用电动匀浆器将采集的组织样品匀浆成糊状，然后用不含胎牛血清的 细胞培养液（见附录）按的比例悬浮，置 孵育或孵育，然后 犵离心 ，收集上清液用于 病毒分离。犐 犛 犃病毒分离 接种单层细胞对上述 中提取的组织匀浆上清液用不含血清的 细胞培养
9、基再作 倍、倍和 倍稀犛 犖犜 释，然后将，和 三种稀释度的上清液分别接种到生长 以内的 单层细胞，按每 的细胞单层接种 ，也可用 、或 细胞单层（事先去除瓶中的培养液）。吸附后，去掉瓶中接种的组织匀浆液，加入 细胞培养维持液（见附录）。置于 培养。传代程序接种组织匀浆液后的细胞，内每天用倒置显微镜观察 出现情况。典型的 为细胞空泡、变圆、脱落。若出现 ，则收集细胞液进行病毒鉴定；若培养 以上仍未出现 ，则一方面可收集上清液，用同样方法接种到新鲜的细胞单层：另一方面将收集的细胞培养液进行病毒鉴定。病毒鉴定在培养结束或 出现后，收集上清液用于病毒鉴定。如果没有 出现，仍要将细胞培养液用间接荧光抗
10、体试验（）或 方法进行鉴定。临床病料中病毒的直接检测 间接荧光抗体试验 制备组织印片取小块中肾，用吸水纸吸去多余的液体，然后在载玻片上做几张触片。空气干燥后，用预冷的 丙酮室温固定 ，可在保存几天或者 长期保存。制备冰冻切片从濒死的鱼收集肾、肝和心的组织块样本，在异戊烷中冻结，再放入液氮变硬，保存于 。在低温下切片，摊放在载玻片上，用预冷的 丙酮固定 ，长期保存。制备细胞培养的样品准备长满单层细胞的组织培养板（孔板或者 孔板）、载玻片或塑料盖玻片飞片。将病毒悬液 倍倍比稀释，每个稀释度设两个平行样。同时设置阳性和阴性对照。细胞接种样品稀释液后置 培养箱中培养，每天观察，若出现 ，则移去细胞培养
11、液，先用 丙酮冲洗一次，然后再加入 丙酮，室温固定 ，移去固定液，空气干燥。如没有产生 ，培养后，按上述方法进行固定，固定干燥好的细胞可保存周而 则可保存较长时间。染色程序将固定好的触片、切片、细胞板、玻片或飞片先用封闭液（见附录）封闭 ，然后加用稀释液（见附录）按 稀释的抗 的单克隆抗体（也可用兔抗 抗体），室温作用或 孵育 。用漂洗液（见附录）漂洗次，第次漂洗时，应尽量保持细胞单层浸在漂洗液中，并且在暗处维持 再去掉洗液。然后用稀释液（见附录）配制的异硫氰酸荧光素标记（）的羊抗鼠 （若前面用兔抗 抗体作用，则这里就用羊抗兔 作用），室温避光作用或 孵育 。用漂洗液（见附录）漂洗次，然后加入
12、 碘化丙锭溶液，室温避光染色 ，将细胞核染成红色，然后用漂洗液（见附录）漂洗一次。立即用荧光显微镜检查，或避光保存 后观察（由于储存，其荧光信号可能会有所减弱）。若染色好的板或飞片不能马上观察，那么应添加防脱色液（见附录），以防止褪色。犛 犖犜 染色结果判定若阴性对照均未观察到荧光，而阳性对照观察到荧光，则实验有效。待检样品中观察到荧光，判断为 阳性；样品中没有观察到荧光，判断为 阴性。免疫组化 取样要求和组织切片制作流程采集濒死或刚死不久的鱼。制备组织块包括样品的固定、脱水、浸蜡、包埋、切片、染色和封片等一系列步骤。固定组织块将新鲜组织按照常规制作组织切片的方法制作。即将发病鱼的中肾和心脏切
13、成左右的小块，用固定液（见附录）固定。为了保证有好的固定效果，固定液和组织块的体积比应为。此时应避免固定时间过长（超过）。样品脱水、浸蜡和石蜡包埋取出固定好的组织块，修整组织块，更换固定液重新固定，自来水冲洗，然后按照箭头所指顺序进行脱水、浸蜡和包埋。乙醇 乙醇 乙醇 乙醇 无水乙醇 无水乙醇 无水乙醇二甲苯（）二甲苯 二甲苯 石蜡 石蜡 包埋。制备切片当包埋了组织块的石蜡冷却固化形成蜡块后，用切片机将其切成厚的薄片。把切片贴在已经硅化的载玻片上，作用 ，除去水分。去蜡和水化将切片在二甲苯中浸泡 以除掉石蜡。重复浸泡一次后再用无水乙醇浸泡两次，每次 ，然后再在 乙醇、乙醇和 乙醇中依次浸泡 以
14、除去二甲苯，最后在蒸馏水中浸泡 重新水化。染色程序 封闭：将上述制备的载玻片放在含有脱脂奶和山羊血清的 柠檬酸缓冲液（）煮两次，每次 ，然后用 浸泡 。加抗体：将上述切片加入用含脱脂奶的 （见附录）稀释兔抗 抗体，作用过夜，然后用含 吐温 的 （见附录）洗涤三次。加酶：将切片放入含有碱性磷酸酶标记的抗兔 ，室温作用 。洗涤：用含 吐温 的 洗涤三次。染色：用染色液（见附录 ）染色 后用自来水洗，再用 苏木素染色液复染。结果判定阳性结果为在血管或心内膜的内皮细胞内，可清晰地看到染成红色的细胞质和细胞核，而阴性结果则没看到任何颜色。检测样品切片如果在内皮细胞内清晰地看到染成红色的细胞核，就可认为阳
15、性。犛 犖犜 通常在心脏和肾脏内皮细胞内的染色反应最强烈。而具有广泛性出血性损害的内皮细胞内，其染色反应比较轻微，甚至没有反应，可能由于感染的内皮细胞正在康复。逆转录聚合酶链式反应（犚 犜 犘 犆 犚）样品处理称取匀浆成糊状后的组织样品 （如：脾、心、肝、肾；也可用病料的细胞分离培养物），放在 的离心管中，先加入 溶液（见附录 ），混匀后再加 溶液到 ，混匀后于 作用。犚 犖 犃抽提在上述中再加入 抽提液（见附录 ），充分混匀；犵离心 ，取上层水相（约 ）；加 抽提液（见附录 ），用力混匀；犵离心 ，取上层水相（约 ）；加入 倍体积 预冷的异丙醇（约 ），倒置数次混匀后，过夜或至少以上沉淀核酸
16、（在不能及时进行 检测的情况下，可置于 倍体积无水乙醇中，长期保存）；犵离心，小心弃上清液，倒置离心管，用滤纸吸干残余液体（应尽量吸干），干燥约 （不能太干，因 不易溶解），加 无 水（见附录 ）溶解，用作 模板。逆转录制备犮 犇 犖 犃 反应体系中，逆转录酶浓缩缓冲液，下游引物，提取的核酸模板，加水，混匀后置 反应。同时设阳性对照、阴性对照和空白对照。取 标准株的细胞悬液和 细胞，用 和 中的方法提取核酸，作为阳性对照和阴性对照的模板；同时取等体积的水作为空白对照的模板。犘 犆 犚反应在 反应体系中，犜 犪 狇酶用浓缩缓冲液，氯化镁，上游引物和下游引物各，反转录产物，犜 犪 狇酶 ，加水 。将此混合物混匀后低速离心，再将反应管置于 扩增仪。先 ，再经 ，进行 次循环，然后 延伸 ，最后保温。琼脂糖电泳用 电泳缓冲液（见附录 ）配制的琼脂糖平板（含 ，见附录 ）。将 扩增产物和加样缓冲液（见附录 ）混匀后加入样品孔。电泳时设立 标准分子量 作对照，电泳约 ，当溴酚蓝到达底部时停止。结果判定在紫外灯下观察结果；阳性对照出现一条 的 片段条带，而阴性对照和空白对照没有该核酸带。待测样品电泳
