1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准?核果树溃疡病菌检疫鉴定方法?发布?实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前?言?本标准按照?给出的规则起草?本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口?本标准起草单位?中华人民共和国山东出入境检验检疫局?本标准主要起草人?吴兴海?厉艳?高文娜?邵秀玲?王英超?封立平?纪瑛?核果树溃疡病菌检疫鉴定方法?范围本标准规定了进出境植物检疫中核果树溃疡病菌的检疫和鉴定方法?本标准适用于进出境植物及其产品中核果树溃疡病菌的检疫和鉴定?规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的?凡是注日期的引用文件?仅注日期的版本适用于本文件?凡是不注日
2、期的引用文件?其最新版本?包括所有的修改单?适用于本文件?分析实验室用水规格和试验方法?进出境植物苗木检疫规程?进出境植物种子检疫规程?原理?分类学地位核果树溃疡病菌?属原核生物界?变形细菌门?变形细菌纲?假单胞杆菌目?假单胞杆菌科?假单胞杆菌属?鉴定依据核果树溃疡病菌的寄主范围?传播途径?形态特征?生物学特性?血清学特性?致病性反应以及分子生物学特征作为制定本检疫鉴定标准的依据?仪器超净台?生物培养箱?仪?凝胶成像系统?电泳仪?酶标仪?荧光显微镜?药品试剂与培养基实验用水?应符合?中一级水的规格?四氮唑?聚合酶?琼脂糖?培养基?推荐采用?和?两种?或其中一种?半选择性培养基?细菌增殖的?培养
3、基?具体配方参考附录?现场检疫?抽样方法棋盘式?五点式或随机抽样?抽样数量?种子对来自核果树溃疡病发生国家和地区?参见附录?的种子按?进行抽样?整株植物或插枝对种苗按?进行抽样?症状检查参见附录?的?症状特征检查植株?切取或将整棵植株取回实验室检验?实验室检验?病菌分离?从种子分离取种子?粒?根据种子的质量?用无菌蒸馏水按?比例浸泡?于?下静置?或过夜?充分混匀后倒出浸出液?取?和?倍稀释液各?分别倒入?和?或?培养基平板?并用?形玻棒在平板上涂抹均匀?每个浓度分离?个?个平皿?条件下培养?观察所产生的菌落?从植物组织材料分离取可疑植物组织?酒精消毒?无菌水洗?次后?放入无菌的培养皿中?用无菌
4、的玻璃棒研碎?滴?滴?滴无菌水于研碎的病组织上?静置?后?用稀释法或无菌的移植环蘸取以上组织液在培养基平板上划线?培养?后?观察菌落生长情况?细菌培养特征及纯化?菌落培养特征菌落具有以下培养基上的特征?使用紫外灯观察菌落荧光?可以确定为可疑菌株?在?培养基上?表现为奶油状凸起菌落?产生强的橙黄色荧光?在?培养基上?出现果聚糖凸起菌落?形成白色或灰白色椭圆状隆起?全缘?粘稠状?在?培养基上?白色菌落?在培养?后有少量晶状体出现?产生微弱的蓝色荧光?含?蔗糖?培养基上?后细菌培养物呈现白色乳状?纯化根据?中核果树溃疡病菌菌落的形态特征?挑取可疑的单个菌落?在?培养基或含?蔗糖?培养基上经?次划线纯
5、化后?在?下培养?对可疑分离物的菌落特征进行观察和描?述记载?观察有无荧光色素产生?并进行革兰氏染色及鞭毛染色?致病性测定?果实接种分离的可疑分离菌株在?培养基或含?蔗糖?培养基上?培养?挑取菌落配制成?的细菌悬浮液?在樱桃果实上针刺接种后?在?下保湿培养?可疑分离物接种不少于?个果实?后记录发病的情况?核果树溃疡病菌产生的伤痕直径约?不凹陷?仅表面变色?为浅褐色或带有橄榄色的浅褐色?用无菌水接种健康果实作为阴性对照?叶片接种将菌液通过注射或针刺等方法接种于?棵?棵樱桃等植株的叶片?第三真叶期前后?高湿条件下培养?核果树溃疡病菌侵染叶片会出现萎焉?变黄等症状?并伴有黑褐色斑点生成?用无菌水接种
6、健康植株叶片作为阴性对照?生理生化反应测试将可疑分离物菌株进行生理生化测试?包括糖发酵?淀粉水解?硝酸盐还原?明胶液化?氧化酶?硫化氢产气?生长温度和?范围等试验?或采用?进行鉴定?血清学鉴定采用?方法进行检测?具体操作程序参见附录?分子生物学鉴定采用?方法进行检测?具体操作步骤参见附录?结果判定如菌落在选择性培养基上的形态特征?致病性接种试验与鉴定特征吻合?且至少采用生化试验?见?见?分子生物学?见?其中一种以上的方法鉴定?复核?结果为阳性者?判定为检出核果树溃疡病菌?否则为未检出?菌种保存从检测样品中分离到并鉴定为核果树溃疡病菌的菌株?应妥善保存?将菌株转接到试管斜面上?恒温培养?然后置于
7、?冰箱中保存?定期?转接?防止病菌死亡?或在菌悬液中加入?的甘油于?下保存?必要时将菌株用真空冷冻干燥机制成冻干粉?下长期保存?附?录?资料性附录?核果树溃疡病菌培养基的配制?培养基?培养基成分比例表见表?表?培养基成分比例表成?分比例?或?号朊蛋白胨?公司?磷酸氢二钾?硫酸镁?甘油?琼脂?公司?蒸馏水?注?称取所有的试剂?倒入适宜的容器内?加?蒸馏水?溶解所有的试剂?在?压力下消毒?缓慢地倒入培养皿内?每个直径?的培养皿?避免产生气泡?使用前?在超净工作台或洁净的环境中使培养基凝固?培养基在超净工作台凝固后直接使用?或者反扣过来装入塑料袋中?在?下保存?最长的保存时间是?周?周?否则抗生素会
8、失效?培养基?培养基成分比例表见表?表?培养基成分比例表成?分比例?或?琼脂?公司?甘油?硼酸?放线菌酮?环己酰亚胺?头孢氨苄?注?硼酸在灭菌前就可加入?抗生素则是溶于酒精配制成母液?灭菌后冷却至?下才加入?培养基?培养基成分比例表见表?表?培养基成分比例表成?分比例?或?琼脂?公司?蔗糖?磷酸氢二氨?氯化钾?硫酸镁?百菌清?枯草杆菌抗生素?杆菌肽?头孢呋辛酸?注?加入琼脂前将?值调节至?抗生素和杀真菌剂则是溶于?酒精配制成母液?灭菌后冷却至?下才加入?培养基?培养基成分比例表见表?表?培养基成分比例表成?分比例?或?琼脂?牛肉提取浓缩汁?酵母提取物?蛋白胨?氯化钠?磷酸二氢钾?磷酸氢二钠?附
9、?录?资料性附录?核果树溃疡病菌相关资料?学名?异名?地理分布瑞士?德国?法国?英国?意大利?匈牙利?荷兰?波兰?前苏联?前南斯拉夫?南非?检疫重要性属?年公布并实施的?中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录?寄主植物自然寄主?樱桃?李?等?传播扩散途径病菌能在溃疡边缘的树皮组织?芽和全部的维管系统越冬存活?春天?病菌在这些过冬的部位繁殖并被雨水散布至花和幼叶?从开花至秋季的落叶?病菌能以附生生物状态生存在无症状的花和叶上?秋季叶落后?病菌能通过新鲜的叶痕进入树体?细菌溃疡病的爆发程度?经常与会给花和叶组织造成伤害的寒冷?霜冻?晚春潮湿的天气或者强烈暴风雨相关?这是因为冷冻使组织易于感染?潮
10、湿天气也使感染更容易发生?症状特征此种病菌主要导致寄主植物产生细菌性溃疡症状?在叶片上?受到侵染后?叶片出现斑点?如果被溃疡环绕?夏季或早秋溃疡分枝的末端部分的叶片枯萎和死亡?叶片斑点黑褐色?多边形至圆形?有时被黄色的色斑环绕?斑点尤其在叶片边缘?接合形成大片的死亡组织?有时坏死的斑点组织脱落?形成碎叶?在果实上?产生细菌性腐烂?果实受害部位形成褐色伤疤?边缘潮湿或水渍状?在茎秆上?病菌可危害树木的大部分结构?在春末和夏季?树干和分枝的溃疡会产生胶状物质?在果柄处?损伤是椭圆的褐色?伴有水渍的边缘?感病的叶芽和花芽在春天无法展开?形成?死芽?芽的基部上经常产生新的溃疡?形态与生化特性菌体杆状?
11、具极生鞭毛?不产生芽孢?好气?革兰氏阴性?病菌无白明胶液化现象?以熊果苷为培养基时?表现出较弱的?葡糖苷酶活性?适宜生长温度为?当以甲酸盐?酯?戊酸盐?或酯?酒石酸盐或?乳酸盐分别为惟一碳源时?细菌生长力很低?在以?酒石酸盐?葡?萄?糖酸盐?苹果酸盐?柠檬酸盐?琥珀酸盐?戊二酸为惟一碳源则生长力很强?糖类和相关化合物中的?亮氨酸?熊果苷等与氨基酸和相关的化合物中的缬氨酸等不能被利用或利用效率低?相关图片资料相关图片资料见图?图?注?引自?研究出版的?一书中?章节?注?引自?研究出版的?一书中?章节?图?健康樱桃植株图?核果树溃疡病菌侵染后的发病樱桃植株?注?引自?研究出版的?一书中?章节?注?
12、引自?研究出版的?一书中?章节?图?自然状态下产生细菌脓液的枝干图?自然状态下着生黑斑的病叶?注?引 自?等 作 者 发 表 于?杂 志 的 题 目 为?一文?图?用无菌蒸馏水人工接种后的樱桃幼苗?注?引 自?等 作 者 发 表 于?杂 志 的 题 目 为?一文?图?用核果树溃疡病菌人工接种后的樱桃幼苗?附?录?资料性附录?核果树溃疡病菌?检测方法?试剂?包被抗体特异性核果树溃疡病菌抗体?酶标抗体碱性磷酸酯酶标记的马铃薯青枯病菌抗体?缓冲液氯化钾?氯化钠?磷酸二氢钾?磷酸氢二钠?吐温?溶解于蒸馏水中?定容至?用浓盐酸?调节?至?下贮存?包被缓冲液将碳酸钠?碳酸氢钠?叠氮钠?溶解于?蒸馏水中?用
13、浓盐酸?调节?至?下贮存?洗涤缓冲液将?缓冲液用浓盐酸?调节?至?下贮存?酶标抗体缓冲液将?缓冲液?小牛血清白蛋白?聚乙烯基吡咯烷酮?叠氮钠?用无菌蒸馏水定溶至?下贮存?底物?缓冲液将二乙醇胺?叠氮钠?溶解于蒸馏水中?定容至?用浓盐酸?调节?至?下贮存?底物?溶液将?硝基酚磷酸钠盐?溶解于?底物缓冲液中?定容至?现配现用?终止反应液将氢氧化钠?溶解于?蒸馏水中?检测方法?包被抗体用包被缓冲液将抗体按说明稀释?加入酶联板的孔中?孔?孵育?清空孔中溶液?洗涤?次?每次?样品制备将待测样品组织剪碎后浸泡于?中?后浸泡液滤纸过滤?离心去上清液?沉淀用包被缓冲液?悬浮?再次?离心去上清液?沉淀悬浮后作为
14、检测样品?加样加入制备好的检测样品?阴性对照?阳性对照?孔?冰箱孵育过夜或?孵育?溶液洗涤?次?每次?加酶标抗体用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度?加入酶联板中?孔?孵育?溶液洗涤?次?每次?加底物将底物?加入到底物缓冲液中使终浓度为?加入酶联板中?孔?室温避光孵育?读数?后在酶联仪?读?值?结果判定?对照孔的?值?缓冲液孔?阴性对照及阳性对照孔?应该在质量控制范围内缓冲液孔和阴性对照空的?当阴性对照孔的?时?按?计算?阳性对照?值?阴性对照?值?重复性基本一致?满足?质量要求?结果判定在阳性对照和阴性对照的吸光值正常?重复性好的情况下?样品?值?阴性对照?值明显?判定为阳性结
15、果?样品?值?阴性对照?值在阈值附近?判为可疑样品?样品?值?阴性对照?值明显?判定为阴性结果?如采用商品化试剂盒?按照试剂盒说明操作并判定结果?附?录?资料性附录?核果树溃疡病菌?检测方法?试剂?电泳缓冲液?储存液?碱?冰乙酸?加水至?用蒸馏水稀释?倍?缓冲液?反应模板制备待测样品组织或分离的可疑菌株按?精编分子生物学实验指南?中的方法提取基因组?纯培养的细菌菌株稀释成菌悬液?也作为?反应模板?反应体系?反应总体积为?包含?氯化钾?氯化镁?浓度为?引物浓度?反应模板?聚合酶?检测?检测引物引物?可检测核果树溃疡病菌?扩增产物分别为?引物序列如下?反应程序?个循环?扩增产物的检测取扩增产物?加入?上样缓冲液?溴酚蓝?质量浓度?蔗糖水溶液?混匀?琼脂糖凝胶电泳?电泳后于凝胶成像系统中成像?保存实验结果?结果判定在阴性和阳性对照成立条件下?即阴性对照在预期大小位置没有产生条带?阳性对照在预期大小位置产生明显条带?如果样品出现与阳性对照大小一致为?的条带?则为阳性?否则为阴性?
