1、SN中华人民共和国进出口商品检验行业标准s N 0 6 6 8 一 1 9 9 7出口肉及肉制品中粘菌素残留量 检验方法杯碟法M e t h o d f o r t h e d e t e r mi n a t i o n o f c o l i s t i n r e s i d u e s in m e a t s a n d m e a t p r o d u c t s f o r e x p o r t -C y l i n d e r p l a t e me t h o d1 9 9 7 一 0 8 一 1 5 发布1 9 9 8-0 1 一 0 1 实施中华人民共和国国家进出口
2、商品检验局发 布S N 0 6 6 8 一1 9 9 7前言 本标准是根据G B/T 1.1-1 9 9 3 标准化工作导则 第1 单元:标准的起草与表述规则 第1 部分:标准编写的 基本规定 及S N/T 0 0 0 1-1 9 9 5 出口 商品中农药、兽药残留 量及生物毒素检验方法标准编写的基本规定 的要求进行编写的。其中 测定方法采用了日 本厚生省1 9 9 0 年编写的 畜、水产食品中 的残留 物质检验方法 中的枯菌素检验方法。技术内容上稍作改 变，经验证后，按规定格式要求作了编辑性修改。在标准中同时制定了抽样和制样方法。本标准的附录 A是标准的附录。本标准的附录 B是提示的附录。本
3、标准由中华人民共和国国家进出口商品检验局提出并归口。本标准由中华人民共和国浙江进出口商品检验局负责起草。本标准主要起草人:费飞金、高雯洁。本标准系首次发布的行业标准。中华人民共和国进出口 商品检验行业标准出口肉及肉制品中粘菌素残留量 检验方法杯碟法M e t h o d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f c o l is t in r e s i d u e s i n me a t s a n d me a t p r o d u c t s f o r e x p o r t -C y l i n d e r p l a t e me t
4、h o dS N 06 68 一 1 997范围本标准规定了出口肉及肉制品中粘菌素残留量检验的抽样、制样和杯碟测定方法。本标准适用于出口鸭肉中粘菌素残留量的检验。抽样和制样2.1 检验批 以不超过 2 5 0 0件为一检验批。同一检验批的商品应具有相同的特征，如包装、标记、产地、规格和等级等。2.2 抽样数量 批量，件最低抽样数，件 1 -2 5 1 2 6-1 0 0 5 1 0 1-2 5 0 1 0 2 5 1-5 0 0 1 5 5 0 1 1 0 0 0 1 7 1 0 0 1 2 5 0 0 2 02.3 抽样方法 按2.2 规定的抽祥件数随机抽取，逐件开启。每件至少取5 0 0
5、g(或一袋)作为 原始样品，抽取的原始样品 总量不少于2 k g，放入清洁容器内，加封后，标明标记，及时送交实验室。2.4 试样制备 从所取回的原始样品中取出部分有代表性样品，将可食部分放人绞碎机中绞碎，充分混匀。用四分法缩分至不少于 5 0 0 g 作为试样。装入清洁容器内，加封后标明标记。2-5 试样保存 将试样于一1 8 以下冷冻保存。注:在抽样及制样的操作过程中，必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。测定方法方法提要用磷酸盐缓冲液抽提试祥中残留的粘菌素，经均质、离心，取上清液进行杯碟法测定。利用样液中的中华人民共和国国家进出口商品检验局1 9 9 7-0 8-1 5批准1 9 9
6、 8 一 0 1 一 0 1 实施 IS N 066 8一 19 97残留 粘菌素与支气管败血 性博代氏杆菌的作用，根据 产生抑菌圈的 大小用标准曲线 法定量。3.2 试剂和材料 除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。3.2.1 枯菌素甲基磺酸钠标准品:已知 效价标准品。1 p g 相当于。6 1 3 p g 粘菌素。3.2.2 缓冲 液 I:p H 6.。士。1,称取8 0.0 g 无水磷酸 二氢钾溶于7 0 0 m L水中，另 取2 0.0 g 无 水磷酸氢二钾溶于 3 0 0 m L水中，两者混合，于 1 2 1 高压灭菌 1 5 mi n,3.2.3 缓冲液 Q:p H 6.0
7、 士0.1.称取8 0.0 g无水磷酸二氢钾溶于7 0 0 mL水中，另取 2 0.0 g无水磷酸氢二钾溶于3 0 0 m L水中，两者混合。称取铁氰化钾以。2%比例溶解于该溶液中。3.2.4 试验菌种:支气管败血性博代氏杆菌(B rn d e t e l l a b r o n c h i s e p t i c a)，由美国标准菌株收藏中心提供，菌株号 A T C C 4 6 1 7,3.2.5 粘菌素标准储备液:称取适量的粘菌素甲基磺酸钠标准品(精确到。.1 m g)，用缓冲液 工 溶解并制备成浓度为1 0 0 0 p g/m l的粘菌素标准储备液。置4 C 保存，可使用8 天。3.2.
8、6 粘菌素标准工作液:分别吸取一定量枯菌素标准储备液，用缓冲液 I 稀释成浓度为。.0 1 2 5,0.0 2 5,0.0 5,0.1,0.2 p g/m L的 粘菌素标准工作液。需当日 配制和使用。3.2.7 培养基 I(见附录A中AD.3.2.8 培养基.(见附录A中A2),3,2-9 培养基 m(见附录A中A3),3.3 仪器和设备3.3 门培养皿:内径 9 0 m m，底部平整光滑的玻璃皿或塑料皿，具陶瓦盖。3.3-2 牛 津杯:不锈钢圆 筒，外径(8.0 1 0.1)m m，内 径(6.0 士0.1)m m，高度(1 0.0 士 0.1)m m,3.3.3 游标卡尺:测量范围。2 0
9、 0 mm,精度。.0 2 m m，或抑菌圈测量仪。3.3.4 绞碎机:电动。3.3.5 均质器:不低于1 0 0 0 0 r/m in,3.3-6 离心 机:不低于4 0 0 0 r/m i n,3.3.7 恒温培养箱:(3 6 士1)C，搁板应保持水平。3.3,8高压灭菌器。3.3.9 恒温水浴锅:恒温士1 C。3.4 测定步骤3.4.1 祥液制备 称取1 0.0 g 试样(精确至。.1 g)于均质杯内，加 入1 0 m L 缓冲液II，搅匀，放置6 0 m i n。均质2 m i n(1 0 0 0 0 r/m i n)后，放入水浴锅中煮沸 3 mi n。移入离心管中离心不少于1 0 m
10、in(4 0 0 0 r/mi n以上)，取出上清液。在残渣中再加 1 0 m L缓冲液 Q，按上述方法均质、离心，取出上清液。合并两次上清液，并定容为2 0 m 1 _ 作为样液。3.4.2 菌悬液的制备 将支气管败血性博代氏杆菌接种于培养基 f 制成的试管斜面上于(3 6-1)C 培养1 6.2 4 h 后，再转种到培养基 II 中，于(3 6 土1)C 培养1 6 2 4 h，制成菌悬液(使用时注意摇匀)。3.4.3 菌悬液最佳用星测定 测试前应先用。.0 2 5 p g/m L 粘菌素标准工作液，对上 述菌悬素液 进行预测试。以不同量的菌悬液加入经熔化并冷却至4 5-5 0 C的培养基
11、 11 中，充分混合，并经(3 6 士1)C培养(1 7 士1)h 后，选择能使该标准工作液产生直 径大于等于1 0 m m清晰完整的 抑菌圈的菌悬液加入量，即为菌悬液的最佳用量。3.4.4 检定平板制备 将培养基m熔化，注2 0 mL于灭菌培养皿内保持水平，待其凝固，作为基层。另取培养基 z 熔化，冷却至4 5-S O C，加入上述测得的最佳菌悬液用量，充分混合，取约 4 m L注入已铺有基层培养基的平板s N 0 6 6 8 一1 9 9 7中作种层，保持水平，使其凝固，制成检定用的平板。所用平板需当天制备。3.4.5 标准曲线的绘制 用粘菌素标准工作液(3.2.6)绘制标准曲线。以。0
12、5 p g/m L浓度的标准工作液为参考浓度;以0.0 1 2 5 p g/m L 浓度的标准工作液作阴 性对照用。每个标准 工作液浓度 取三个检定平板作为一组.每 个平板上置4 个牛津杯，使牛津杯在半径为2.5 c m的圆面成9 0 0 角间距，对角 两个 杯中注 满0.0 5 p g/m L参考浓度标准工作液，另两个对角杯中注满其他浓度的一种标准工作液。4 个浓度标准工作液共 1 2 个检定 平板，用于制备标准曲 线。其中0.0 5 p g/m L参考浓度的标准工作液将得到2 4 个抑菌圈 直径的 数值，而其他标准工作液分别得到 6 个抑菌圈直径的数值。盖 好平皿盖，置(3 6 士1)培养
13、(1 7 士 1)h,翻转平板，除去牛津杯，测量各个浓度产生的抑菌圈 直径(精确到。.1 m m)，求 得各自 的平 均值。再求出。0 5 p g/m L 参考浓度2 4 个 抑菌圈直径的平均值。用参考浓度的抑菌圈直径的总平均值减去每组平板参考浓度的抑菌圈直径平均值的差，即为各组平板的校正值。将校正后的值用式(1)和式(2)算出L和H 点的直径值，在半对数坐标纸上，以抑菌圈直径为横坐标(算术级)，粘菌素浓度为纵坐标(对数级)，通过L和 H点连一直线即为标准曲线。7 a+4 b+c一 2 d 1 0(1)7 d十 4 c+b一 2 a 1 0(2)式中:L-标准曲线上最低浓度抑菌圈的直径，m m
14、;H-标准曲线上最高浓度抑菌圈的直径，m m;b 参考浓度。.0 5 p g/m L 的2 4 个抑菌圈直径的 平均值，m m;a,c,d 分别表示标准曲线上其他标准工作液浓度(0.0 2 5,0.1,0.2 p g/m L)的抑菌圈直径经校正 后的平均值，mm,3.4.6 样液的测定 每份祥液取 3 个检定平板.在每个平板上置 4 个已灭菌的牛津杯(按制备标准曲线方法放置)，在对角的 2只牛津杯里注满被检样液，在剩余的 2只牛津杯里分别注满粘菌素参考浓度标准工作液(即0.0 5 p g/m L)。于(3 6 士1)C 培养(1 7 士1)h,翻转平板，除去牛津杯。如有抑菌圈产生，量取抑菌圈直
15、 径(精确到0.1 m m).3.5 结果的计算和表述 如样液抑菌圈的直径小于 1 0 mm，即报告为“阴性”。如样液抑菌圈的直径大于等于 1 0 mm，求出每组三个检定平板上样液和参考浓度标准工作液抑菌圈直径的平均值，经校正后，从标准曲线上查出相应的粘菌素的浓度，通过式(3)，计算试样中粘菌素残留的含量:(3)c一川 -X式中:X试样中粘菌素残留的含量,mg/k g;c 从标准曲线上查得样液中粘菌素浓度，k g/m L;。每毫升最终徉液所代表的试样量,g 注:如测定结果呈阳性，即所显的抑菌圈直径的平均值大于等于1 0 mm.必要时尚需进行确证试验(可用薄层层析 法，参见附录t 3)以证明抑菌
16、物确系粘菌素。测定低限和回收率测定低限本方法的测定低限为。0 5 m g/k g.回收率s N 06 68 一 1 997鸭肉中枯菌素添加浓度及其回收率的实验数据:0.0 5 0 m g/k g 时，回 收率为7 8.0 写，0.1 0 0 m g/k g 时，回 收率为8 5.0%:0.2 0 0 m g/k g时，回收率为 g o.O%eS N 0 6 6 8 一1 9 9 7 附录A(标准的附录)培养基k 1 培养基 I 蛋白 陈1 0.0 g 牛肉 浸膏5.0 g 抓化钠2.5 9 琼脂1 5.0 g 水1 0 0 0 m L 将上述成分于水中加热溶解，调节p H使其灭菌后p H为6.5 士。.1，分装于试管或克氏瓶中，于1 2 1 高压灭菌1 5 m i n。灭菌后可制成斜面。A 2 培养荃 I 蛋白豚1 0.0 g 牛肉 浸膏5.0 9 氯化钠2.5 g 水1 O O O m L 将上述成分溶解于水中，调节p H使其 灭菌后p H为7.。士。.1，分装于试管或 克氏 瓶中，于1 2 1 C 高压 灭菌1 5 m i n.A 3 培养垂，蛋白 陈1 7.0 g 氯化钠5.0
