1、ICS 67.120.30 B 52 备案号：19162-2006 北 京 市 地 方 标 准 DB DB11/T 3712006 鳄龟 American Snapping Turtle 2006-07-25 发布 2006-10-01 实施 北京市质量技术监督局 发布 DB11/T 3712006 I 前 言 本标准的附录 A 为规范性附录。本标准由北京市农业局提出并归口。本标准起草单位：北京市水产技术推广站。本标准主要起草人：杨华莲、张黎、潘志、宣庭孝、高南、赵睿。DB11/T 3712006 1 鳄 龟 1 范围 本标准规定了鳄龟（Chelydra Serpentina）的主要生物学特性
2、、肌肉营养成分分析、细胞遗传学特性、生化遗传学特性、分子遗传学特性，以及检测方法。本标准适用于鳄龟的种质鉴定。2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 5009.3-2003 食品中水分的测定 GB/T 5009.4-2003 食品中灰分的测定 GB/T 5009.5-2003 食品中蛋白质的测定 GB/T 5009.6-2003 食品中脂肪的测定 GB
3、17718-1999 鳙 GB/T 18654.2 养殖鱼类种质检验 第2部分：抽样方法 GB/T 18654.12-2002 养殖鱼类种质检验 第12部分：染色体组型分析 3 名称与分类 3.1 学名 鳄龟（Chelydra Serpentina ）3.2 分类位置 鳄龟科（Chelydridae）,鳄龟属（Schweigger），鳄龟（Chelydra Serpentina）。4 主要生物学特性 4.1 外部形态特征 4.1.1 外形 头伸出体外，不能缩入甲壳内，上下颌略尖，眼圆。尾长而尖，尾两侧有肉突，尾背前2/3处有一条鳞皮状隆起，呈锯齿状，皮呈褐色。被壳薄而坚，边缘有许多齿状突起，腹
4、甲小，腹部淡黄色或浅褐色。前后爪较长，趾间具蹼，四肢较长且发达粗壮。背部由13枚-15枚背甲组成，有3条模糊棱。鳄龟正面图见图1，腹面图见图2。DB11/T 3712006 2 图 1 鳄龟正面图 图 2 鳄龟腹面图(1)吻(2)颈(3)前肢 (4)背甲 (1)吻 (2)下颌 (3)颈 (4)前肢(5)背甲缘盾 (5)后肢 (6)爪 (7)尾 (6)后肢(7)爪(8)尾(9)腹甲 4.1.2 可数性状 椎盾：5，颈盾：2，肋盾：8-10，缘盾：22，臀盾：2，喉盾：2，肱盾：2，胸盾：2，腹盾：2，股盾：2，甲桥：6，腋盾：2，侉盾：2，肛盾：1-2。4.1.3 可量性状 不同年龄组的鳄龟背甲
5、、腹甲长和宽的实测值见表1。表1 不同年龄组鳄龟背甲、腹甲长和宽的实测值（单位：cm）组别 项目 1 龄 2 龄 3 龄 4 龄 背甲长 13.440.49 16.900.35 20.100.85 22.700.56 背甲宽 11.560.65 16.800.67 21.600.84 22.700.73 腹甲长 10.650.52 12.100.53 13.800.72 16.000.58 腹甲宽 10.580.63 15.000.64 17.700.65 20.800.74 4.2 内部构造特征 4.2.1 脊柱骨 颈椎8枚，胸椎10枚，荐椎2枚，尾椎20枚。4.2.2 消化道 全口无齿，口
6、裂有角质化硬鞘。食道细而长，胃较宽大，小肠盘曲位于十二指肠后。4.2.3 消化腺 由肝、胰和胆等组成。肝深褐色且较大，分左右两叶，胆囊在肝叶中，胰腺乳黄色紧靠十二指肠。4.2.4 肺 扁平长圆囊状，2叶。鳄龟的内部结构图见图3。DB11/T 3712006 3 （1）气管 （2）食道 （3）心脏（4）肝脏 （5）胃 （6）胰脏（7）肺脏 （8）胆囊 （9）卵巢（10）小肠 （11）膀胱 （12）脾脏（13）输卵管 （14）肾脏 （15）泄殖腔（16）副膀胱 （17）泄殖腔孔 图3 鳄龟（雌性）内部结构图 4.3 生长 不同年龄组鳄龟的体重与体厚实测值见表2。表2 不同年龄组鳄龟的体重、体厚实测
7、值 组别 项目 1 龄 2 龄 3 龄 4 龄 体重（g）926.40100.42 1200120.52 1900145.38 2700210.45 体厚（cm）6.890.40 7.30.53 9.80.41 11.20.40 4.4 繁殖 4.4.1 性成熟年龄 3龄-4龄。4.4.2 繁殖季节 4月-6月。4.4.3 年性成熟次数 性成熟个体性腺每年成熟一次，一次产卵。4.4.4 产卵量 每只性成熟雌龟每年产卵20枚-80枚。5 肌肉营养成分 5.1 主要营养成分 鳄龟肌肉蛋白质、粗脂肪、灰分、水分等营养含量指标见表3。DB11/T 3712006 4 表3 肌肉（后肢基部）主要营养成分
8、 检测项目 营养指标（%）粗蛋白 19.32 粗脂肪 0.40 灰分 0.88 水分 77.9 5.2 氨基酸含量 表4 肌肉（后肢基部）主要营养成分 检测项目 氨基酸含量（%）天门冬氨酸 1.65 苏氨酸 0.86 丝氨酸 0.83 谷氨酸 2.95 甘氨酸 1.00 丙氨酸 1.10 胱氨酸 0.20 缬氨酸 0.88 蛋氨酸 0.52 异亮氨酸 0.85 亮氨酸 1.45 酪氨酸 0.68 苯丙氨酸 0.71 赖氨酸 1.52 组氨酸 0.60 精氨酸 1.10 氨基酸（以鲜基计）总量17.68%脯氨酸 0.78 6 细胞遗传学特性 6.1 体细胞染色体 2 倍数 2n=52 6.2 核
9、型公式 12m+4sm+6st+2t+28cm NF=68 6.3 染色体组型 鳄龟染色体中期分裂相见图4，染色体组型见图5。DB11/T 3712006 5 图 4 染色体中期分裂相 图 5 染色体组型 7 生化遗传学特性 肌肉的乳酸脱氢酶（LDH）同工酶有8条谱带；肝脏的酯酶（EST）同工酶有5个基因座位，有5条谱带。肌肉的乳酸脱氢酶（LDH）同工酶电泳图谱见图6。肝脏的酯酶（EST）同工酶电泳图谱见图7。图 6 肌肉的乳酸脱氢酶（LDH）同工酶电泳图谱 图 7 肝脏的酯酶（EST）同工酶电泳图谱 8 分子遗传学特性 用20个RAPD（随机扩增多态性DNA技术，又称任意引物PCR）引物对其
10、基因组DNA进行分析，确认引物S19 的分析结果能够反应其基因组的多态性特征。引物S19序列：tgcccgtcgt见图8。O OEst-5 Est-4 Est-3 Est-2 Est-1 DB11/T 3712006 6 图 8 基因组 DNA RAPD 图谱 M：分子量标准 C：对照样品 G：鳄龟样品（4个样品）9 检测方法 9.1 生物学性状测定 参照GB 17718规定的方法测定。9.2 肌肉营养成分测定 9.2.1 样品制备 取活体后肢基部肌肉，于105烘干，粉碎。肌肉各成分测定按照GB/T 5009.3、GB/T 5009.4、GB/T 5009.5、GB/T 5009.6规定的方法
11、进行。9.2.2 氨基酸 取活体后肢基部肌肉，于105烘干，粉碎。肌肉各成分测定按照GB/T 5009.3、GB/T 5009.4、GB/T 5009.5、GB/T 5009.6规定的方法进行。9.3 细胞遗传学特性检测 根据GB/T 18654.12的相关规定进行。9.4 生化遗传学性状分析 9.4.1 样品制备 样品加3%辅酶I液匀浆，低温离心，至上清液澄清。整个制备过程均在低温下操作。9.4.2 电泳分析 使用水平淀粉凝胶电泳仪。淀粉胶浓度为10%，酯酶（EST）电泳缓冲液为三羟甲基氨基甲烷（Tris）-硼酸-乙二胺四乙酸四钠盐，乳酸脱氢酶（LDH）电泳缓冲液为甲基氨基甲烷（Tris）-
12、柠檬酸，pH值7.0。将10%浓度水解淀粉煮好后倒入制胶模内，待凝固后，切一横裂缝，用滤纸片吸取样品的上清液插入裂缝中。电泳电压为250V，电泳8h-10h，电泳恒温4，电泳后横切成0.2cm左右的薄片，浸入染色液中保温染色。同工酶染色液配方见附录A。9.4.3 结果判定 将测定结果对照图6、7谱带确定该种同工酶的编码座位数和多态座位的基因数。9.5 分子遗传学特性分析 9.5.1 基因组 DNA 的提取纯化 DB11/T 3712006 7 取肌肉剪碎用组织列解液（0.5mol EDTA，PH值8.0；200g/mL ProteinnseK；0.5%Snrcosyl）于55消化过夜，次日用酚
13、、氯仿、异戊醇（24：24：1）抽提三次，RNaseA消化去除RNA后再抽提一次，然后用2150mmol/L Tris.HCl(pH 8.0)、10 mmol EDTA（pH 8.0），透析至OD2700.05，检测DNA浓度，置4保存备用。9.5.2 RAPD 引物及扩增条件 用PE-9600型PCR扩增仪，RAPD扩增引物OPP及OPM组计15个。RAPD反应：10mmol/L Tris.HCl（pH 8.3），50 mmol/L KCl，2.0 mmol/L MgCl2，0.001%明胶；Dapt.dGTP、Dctp，dTTP各为0.1 mmol/L:引物15g，基因组DNA 20g，1
14、单位Tag聚合酶。于 93.5变性1min，36退火1min，72延伸2min，计45个循环，循环结束后延伸5min，扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。9.5.3 琼脂糖凝胶电泳 凝胶浓度为1.5%的琼脂糖，胶中含0.5g/mL溴化乙锭。电泳缓冲液为TBE，电泳在室温下进行，电压为15V，电泳时间为16h。电泳毕在紫外灯下观察拍照。10 检测规则 10.1 检测分类 检测分为鉴定检测和质量一致性检测。10.2 检测项目 鉴定检测项目包括外部形态特征、可量性状、可数性状。质 量一致性检测项目包括细胞遗传学特性、生化遗传学特性、分子遗传学特性。10.3 取样 样品龟的抽样按GB/T 18654
15、.2规定执行。10.3.1 组批 以同龄期的鳄龟为同一批。10.4 判定规定 各项检验指标在标准范围内则判定为鳄龟良种。DB11/T 3712006 8 附 录 A（规范性附录）同工酶染色液配方 A.1 酯酶染色液配方 酯酶染色液配方见表 A.1 表 A.1 酯酶染色液配方-乙酸萘酯（mg）坚牢蓝B盐（mg）三羟甲基氨基甲烷-柠檬酸缓冲液（1mol，PH 7.0）(mL)蒸馏水(mL)40 100 10 10 A.2 乳酸脱氢酶染色液配方 乳酸脱氢酶染色液配方见表A.2。表 A.2 乳酸脱氢酶染色液配方 乳酸钠(mL)辅酶I(mg)氮蓝四唑(mg)吩嗪甲硫酸(mg)三羟甲基氨基甲烷-柠檬酸缓冲液（1mol，PH 8.6）(mL)蒸馏水(mL)0.5 6 2 1 10 10
