1、 ICS 65.020.30 CCS B 41 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 27412022 间接 ELISA 方法检测羊溶血性曼氏 杆菌抗体 Indirect ELISA for detection of antibody of sheep mannheimia haemolytica 2022-07-29 发布 2022-08-29 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 27412022 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区农牧业科学院提出。本文件由内蒙古畜牧业标准化
2、技术委员会（SAM/TC19）归口。本文件主要起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院。本文件主要起草人：张月梅、赵世华、宋越、白帆、王娜、戴伶俐、张帆、杨斌、刘威。DB15/T 27412022 1 间接 ELISA 方法检测羊溶血性曼氏杆菌抗体 1 范围 本文件规定了应用间接ELISA检测羊溶血性曼氏杆菌抗体的方法。本文件适用于羊溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白抗体检测。2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。酶联免疫吸附试验 enzyme linked immunosorbent assay，ELISA 以固相载体吸附技术和免疫酶技术相结合建立的一种
3、检测方法，通常在合适的载体上，酶标记抗体或抗原与相应的抗原或抗体形成酶标记的抗原-抗体复合物，在一定底物参与下，复合物上的酶催化底物，使其水解、氧化或还原成另一种带色物质，酶的降解底物和呈现色泽成正比，可以使用酶标仪进行测定，从而计算出参与反应的抗原或抗体的种类和含量。辣根过氧化物酶 horse radish peroxidase，HRP 与碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）常被用于免疫酶技术中的抗体或抗抗体的标记，而形成仍保持免疫学活性和酶活性的酶标记物，进而催化底物产生水解、氧化或还原反应，最终生成可溶或不可溶有色物质。溶血性曼氏杆菌 mannheimia ha
4、emolytica，Mh 巴氏杆菌科曼氏杆菌属的微生物，球杆状或短杆状菌，两端钝圆，革兰染色阴性，典型两端深染，中间浅，单个或成双存在，无鞭毛，有荚膜，不形成芽孢。3,3,5,5-四甲基联苯胺 tetramethylbenzidine，TMB 用于酶联免疫吸附试验（ELISA）的可视化试剂。其可在辣根过氧化物酶（HRP）的催化下发生颜色变化。DB15/T 27412022 2 异丙基-D-硫代半乳糖苷 isopropyl-d-thiogalactoside，IPTG 一种作用极强的诱导剂，它可以作为具有lac或tac等启动子的表达载体的表达诱导物使用。吐温-20 tween-20 一种非离子型
5、表面活性剂。卡那霉素 kanamycin 一种蛋白质生物合成抑制剂，从卡那霉素链霉菌（Streptomyces kanamyceticus）中分离得到。吸光度 optical density，OD 表示被检测物吸收掉的光密度，是检测方法里的专有名词，检测单位用OD值表示。4 试剂 羊溶血性曼氏杆菌 PlpE 蛋白 阳性血清 分离鉴定并经测序确定为溶血性曼氏杆菌的菌液制备全菌灭活抗原，并用其免疫3月龄羔羊制备标准阳性血清，经间接血凝实验验证为阳性。阴性血清 无母源抗体，经间接血凝实验结果为阴性。酶结合物 HRP标记的抗羊IgG抗体，工作浓度参照所购产品说明书。碳酸盐包被液 称取碳酸钠1.0 g和
6、碳酸氢钠3.0 g，溶于800 mL超纯水，调节pH值为9.49.6，用超纯水定容至1000 mL。磷酸盐缓冲溶液 称取磷酸二氢钾0.24 g，磷酸氢二钠1.42 g，氯化钠8.0 g，氯化钾0.2 g，超纯水800 mL溶解后，调整pH值为7.4，超纯水定容至1000 mL，121 高压蒸汽灭菌15 min。封闭液 称取脱脂乳5.0 g，溶于100 mL磷酸盐缓冲液中。DB15/T 27412022 3 洗涤液 向PBS溶液中添加0.05%Tween-20，即每1 L PBS中添加500 L Tween-20，混匀后室温保存。稀释液 量取5.0 mL马血清溶于95.0 mL PBS中。底物液
7、 A 称取TMB 200.0 mg，无水乙醇（或二甲基亚砜）100 mL，加超纯水至1000 mL。底物液 B 十二水合磷酸氢二钠14.60 g，柠檬酸9.33 g，0.75%过氧化氢6.4 mL，调pH值为5.05.4，加超纯水至1000 mL。终止液 量取5.6 mL浓硫酸（18 mol/L）与94.4 mL超纯水混合，冷却至室温保存。TSA 称取胰酪胨15.0 g，大豆木瓜蛋白酶水解物5.0 g，氯化钠5.0 g，超纯水1000 mL，混合，微热溶解，调节pH值为7.3，加入15.0 g琼脂，加热融化后，121 高压蒸汽灭菌15 min，冷却至约60，在无菌操作条件下倾注约20 mL至无
8、菌平皿中。加盖后在室温放至凝固。制备好的培养基宜在2 8 保存。TSB 称取胰酪胨15.0 g，大豆木瓜蛋白酶水解物5.0 g，氯化钠5.0 g，超纯水1000 mL，混合，微热溶解，调节pH值为7.3，121 高压蒸汽灭菌15 min。制备好的培养基宜在2 8 保存。LB 液体培养基 称取胰酪胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化钠10.0 g，超纯水1000 mL，混合，微热溶解，调节pH值为7.3，121 高压蒸汽灭菌15 min。制备好的培养基宜在2 8 保存。LB 固体培养基 称取胰酪胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化钠10.0 g，超纯水1000 mL，混合，微热溶解，
9、调节pH值为7.3，加入15.0 g琼脂，加热融化后，121 高压蒸汽灭菌15 min，冷却至约60，在无菌操作要求下倾注约20 mL至无菌平皿中。加盖后在室温放至凝固。制备好的培养基宜在2 8 保存。5 仪器与设备 恒温培养箱：37。酶标仪。天平：称量范围 0 g500 g，读数精确度 0.01 g。恒温摇床：37。低温离心机。DB15/T 27412022 4 微量移液器(10 L、200 L、1000 L)和配套吸头。多道移液器(300 L)。酶联反应板。血清稀释板（96 孔一次性 U 型血凝板或 96 孔细胞培养板）。冰箱。一次性采血器(5 mL，10 mL)。6 血清样本的处置 样本
10、采集及处理 血液样本采集时，每只羊用一个采血器，通过颈静脉采集静脉血，每次采血不少于4 mL，45倾斜采血器室温静置2 h，待血液凝固后，将其放入冰箱2 8 3 h后，4000 r/min离心10 min，用移液器小心吸出上层血清。样本存放及运送 血清样本若在一周内进行检测，可在冰箱中2 8 保存，如果超过一周检测，应将样品置于-20 保存，测试前应将样本提前恢复至室温。运输过程注意冷藏，可将采集的血清样本用冰袋、保温桶或车载冰箱进行运输，应尽量缩短运输时间，确保样品有效。按照兽医实验室生物安全技术管理规范进行生物安全标识。7 方法 包被抗原的制备 7.1.1 重组载体的构建 将溶血性曼氏杆菌
11、分离菌株划线接种于5%马血清的TSA培养基，连续划线3次，挑取大小适中的单菌落接种于含5%马血清TSB培养基中，于37 培养12 h16 h后，用细菌DNA提取试剂盒提取全菌DNA。以该DNA为模板，PlpE-F/PlpE-R为引物（附录A）扩增PlpE基因片段，将纯化后的基因片段和pET-28b原核表达载体分别用Nde I和Xho I限制性内切酶酶切，经连接酶连接并转化于大肠杆菌感受态细胞后涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基，经37 培养过夜，挑取单菌落经LB培养基培养后，提取质粒。随后对质粒进行双酶切、测序鉴定，确定成功构建PlpE-pET-28b原核表达载体。7.1.2 目的蛋白的纯化
12、将含有质粒PlpE-pET-28b的大肠杆菌原核表达载体在含有终浓度为100 g/mL卡那霉素的LB固体培养基上划线，37 培养过夜后挑取单个菌落，接种于添加有终浓度为100 g/mL卡那霉素的LB培养基中，37 振荡培养过夜。将菌种液以1：100的比例接种于新鲜的含100 g/mL卡那霉素的LB液体培养基中，置于摇床中37 振荡培养至OD600为0.6，加入IPTG使其终浓度为1 mmol/L，继续培养4 h，离心收集菌体，将菌体沉淀悬浮于PBS中，经超声波裂解菌体细胞，12000 r/min，4，离心20 min后收集上清液体，将上清液体通过0.45 m滤膜，过滤去除杂质。然后将处理好的细
13、菌诱导裂解样品经镍柱亲和层析纯化。BCA法测定纯化的蛋白浓度。7.1.3 目的蛋白的检测 DB15/T 27412022 5 PlpE蛋白通过BCA法测定蛋白质浓度。按照Western blot实验步骤用DAB显色试剂盒显色，分析在相应位置出现的蛋白条带。ELISA 检测 7.2.1 包被：将目的蛋白用 0.05 mol/L、pH 值为 9.6 的碳酸盐缓冲液(CBS)稀释为 0.25 g/mL，按100 L/孔加入至酶联反应板，置 4 冰箱过夜，次日甩掉包被液，用 PBST 洗涤酶联反应板 3 次。7.2.2 封闭：用移液器按 300 L/孔向酶联反应板加入新鲜配制的封闭液，37 恒温箱孵育
14、 1 h；取出后加 PBST 洗板 3 次。7.2.3 加样：用 PBS 按体积比 1:100 稀释待检血清、阳性、阴性对照血清，稀释后血清 100 L/孔，37 恒温箱孵育 1 h，用 PBST 洗板 3 次。吸取不同血清时需要更换洗头。7.2.4 加酶结合物：取稀释好的酶结合物，酶联反应板 100 L/孔加注，37 恒温箱孵育 30 min，洗涤同前。7.2.5 加底物显色：将底物液 A 和底物液 B 等体积混合制成的 TMB 底物显色液按 100 L/孔加注，室温避光作用 20 min，用 1 mol/L H2SO4 按 100 L/孔加入酶联反应板，终止显色反应。7.2.6 数据读取：
15、用酶标仪在波长 450 nm 处测定每孔的吸收值，每个样品每次平行 2 孔，取其平均值。判定标准的确定 在已经确定的间接ELISA条件下，对经间接血凝试验检测抗体阴性的20份羊血清，用重组PlpE抗原包被的酶标板进行OD450的测定，结果进行统计学分析，将+3s=0.411作为溶血性曼氏杆菌阳性临界值，+2s=0.33作为阴性临界值，即S/P大于等于0.411时判定为阳性，0.411大于S/P大于等于0.33时判定为疑似，S/P小于0.33时判定为阴性。S/P=(样品血清A值阴性血清A值)/(阳性血清A值阴性血清A值)DB15/T 27412022 6 A A 附录A （资料性）溶血性曼氏杆菌 PlpE 基因的扩增 溶血性曼氏杆菌PlpE基因的扩增引物见表A.1。表A.1 用于PlpE目的片段扩增的引物 引物 序列 PlpE-F CGCCATATGGGAGGAAGCGGTAGCG（SEQ ID No.1）PlpE-R CCGCTCGAGTTATTTTTTCTCGCTAAC（SEQ ID No.2）注：下划线处为酶切位点Nde I和Xho I。DB15/T 27412022 7 参考文献 1 兽医实验室生物安全技术管理规范(中华人民共和国农业部公告第302号)
