1、 ICS 11.220 CCS B 41 DB 51 四川省地方标准 DB51/T 30142023 家畜螨病诊断与防控技术规范 Standard of dignositic and control techniques of livestock acariasis 2023-02-07 发布 2023-04-08 实施 四川省市场监督管理局 发 布 DB51/T 30142023 I 目次 前言.II 1 范围.3 2 规范性引用文件.3 3 术语和定义.3 4 诊断.3 5 防治.7 附录 A（资料性）疥螨病临床症状.8 附录 B（资料性）痒螨病临床症状.9 附录 C（资料性）足螨病临床症
2、状.10 附录 D（资料性）虫体形态学.11 附录 E（规范性）ELISA 检测试剂配制和重组抗原制备.13 附录 F（规范性）PCR 检测试剂配制与 PCR 扩增结果参考.14 参考文献.15 DB51/T 30142023 II 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由四川省农业农村厅提出、归口并解释。本文件起草单位：四川农业大学。本文件主要起草人：杨光友、古小彬、何冉、徐璟、谢跃。本次为首次发布。DB51/T 3014DB51/T 301420
3、232023 3 家畜螨病诊断与防控技术规范 1 范围 本文件规定了家畜螨病诊断与防控技术规范。本文件适用于家畜螨病的诊断、检疫与防治。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 36195-2018 畜禽粪便无害化处理技术规范 NY/T5030-2016 无公害农产品 兽药使用准则 中华人民共和国兽药典 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 家畜螨病 livestock acariasis 由疥螨科（Sarco
4、ptidae）的疥螨（Sarcoptes scabiei）和痒螨科（Psoroptidae）的痒螨（Psoroptes ovis）、足螨（Chorioptes）寄生于家畜（牛、羊、猪、兔和马）皮肤所引起的外寄生虫病的统称。3.2 疥螨病 sarcoptic mange 由疥螨（Sarcoptes scabiei）寄生于家畜皮肤表皮内引起相应的临床症状的外寄生虫病。3.3 痒螨病 psoroptic mange 由绵羊痒螨（Psoroptes ovis）寄生于家畜皮肤表面引起相应的临床症状的外寄生虫病。3.4 足螨病 choroptic mange 由牛足螨（Chorioptes bovis）和
5、德州足螨（Chorioptes texanus）寄生于家畜皮肤表面引起相应的临床症状的外寄生虫病。4 诊断 疥螨病、痒螨病和足螨病的临床症状 4.1 4.1.1 疥螨病 家畜疥螨病多始发于宿主皮肤柔软、被毛短而少的部位，主要以剧痒，结痂，皮肤增厚和畜体消瘦为主要临床特征，不同动物的发病部位存在差异（见附录A）。DB51/T 3014DB51/T 301420232023 4 4.1.2 痒螨病 家畜痒螨病多始发生于毛浓密的部位，主要以瘙痒，结痂，脱毛和畜体消瘦为主要临床特征，不同动物的发病部位存在差异（见附录B）。4.1.3 足螨病 家畜足螨病多始发生于皮肤细嫩的部位，主要以瘙痒，结痂和患处脱
6、毛为主要临床特征，不同动物的发病部位存在差异（见附录C）。疥螨病、痒螨病和足螨病的显微镜镜检 4.2 4.2.1 病料的采集 4.2.1.1 疥螨病病料的采集 剪去患病部和健康部皮肤交界处的毛后，采用经火焰消毒后的小刀垂直于皮肤面用力刮取交界处痂皮，直至刮处皮肤微有出血痕迹，将刮取物收集到容器内，待检。刮破处皮肤用碘伏等消毒剂进行消毒处理。4.2.1.2 痒螨病病料的采集 用消毒小刀刮取患病部皮肤表面的痂皮，将痂皮收集到容器内，待检。取痂皮处皮肤用碘伏等消毒剂进行消毒处理。4.2.1.3 足螨病病料的采集 用消毒小刀用力刮取患病部皮肤表面的痂皮，将痂皮收集到容器内，待检。取痂皮处皮肤用碘伏等消
7、毒剂进行消毒处理。4.2.2 显微镜镜检 4.2.2.1 热源法 将 4.2.1 采集的病料放入平皿内，将平皿放入 2537的恒温箱中 0.5h1h 后，将平皿置于显微镜下检查。4.2.2.2 直接涂片法 将4.2.1采集的病料放置于载玻片上，滴加1滴5%甘油（丙三醇）水溶液，加盖另一新的载玻片，搓压载玻片至病料散开，移去病料上方的载载片，加盖玻片后，置显微镜下检查。4.2.2.3 浓集法 当螨虫数量较少或病料采自死亡家畜时，可采用浓集法收集螨虫镜检。将4.2.1刮取的较多病料放入10%氢氧化钠溶液并浸泡过夜或加热煮5min左右，待其溶液自然沉淀15min，取沉淀物镜检。或将上述沉淀物转入试管
8、中，再加入60%硫代硫酸钠溶液，试管口加盖玻片，静置5min10min后，取盖玻片镜检。4.2.3 镜检结果判定 4.2.3.1 病料中镜检到疥螨虫体或虫卵（见附录 D.1），判定为显微镜镜检阳性。4.2.3.2 病料中镜检到绵羊痒螨虫体或虫卵（见附录 D.2），判定为显微镜镜检阳性。4.2.3.3 病料中镜检到足螨虫体或虫卵（见附录 D.3），判定为显微镜镜检阳性。DB51/T 3014DB51/T 301420232023 5 疥螨病和痒螨病的间接 ELISA 抗体检测 4.3 4.3.1 材料准备 4.3.1.1 试剂 碳酸盐缓冲液（0.05M,pH 9.6）、PBS缓冲液（0.01M,
9、pH 7.4）、PBST缓冲液（0.01M,pH 7.4）、2M硫酸（2M H2SO4）、LB液体培养基的配制见附录E.1。辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗：HRP-羊抗牛IgG，用于检测牛血清；HRP-兔抗羊IgG，用于检测羊血清；HRP-羊抗猪IgG，用于检测猪血清；HRP-羊抗兔IgG，用于检测兔血清；HRP-兔抗马IgG，用于检测马血清。4.3.1.2 阳性血清和阴性血清对照样品 疥螨阳性血清采自经显微镜镜检到疥螨虫体或虫卵的动物血清；疥螨阴性血清采自无疥螨流行史且经显微镜镜检呈阴性的动物血清。痒螨阳性血清采自经显微镜镜检到痒螨虫体或虫卵的动物血清；痒螨阴性血清采自无痒螨流行史且经显
10、微镜镜检呈阴性的动物血清。4.3.1.3 重组抗原制备 疥螨烯醇化酶重组抗原（rSar-Eno）和痒螨丝氨酸蛋白酶抑制剂重组抗原（rPsoc 27）按照附录E.2制备。4.3.2 操作步骤 4.3.2.1 抗原包被 用碳酸盐缓冲液将抗原稀释到最佳浓度（rSar-Eno14.5g/mL，rPsoc2746.0g/mL）后加入96孔聚乙烯板，每孔100L，4包被过夜。次日，弃孔内液体，每孔加入PBST缓冲液300L，洗板3次，每次 min，拍干。4.3.2.2 加封闭液 每孔加5%脱脂奶粉（W/V，5g脱脂奶粉+100mL PBS）300L，37封闭1.5h。弃孔内液体，洗涤同4.3.2.1。4.
11、3.2.3 加血清样品 每孔加入用PBS缓冲液稀释的待检血清100L（rSar-Eno以1:640倍稀释；rPsoc 27以1:100倍稀释），每板同时设置标准阳性血清对照孔、标准阴性血清对照孔以及空白（稀释液）对照孔。37温育1h后，弃孔内血清，洗涤同4.3.2.1。4.3.2.4 加酶标二抗 用PBS缓冲液将辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗稀释至推荐工作浓度，加入100L，37温育1h。弃孔内液体，洗涤同4.3.2.1。4.3.2.5 加底物显色 每孔加入底物TMB（3,3,5,5-四甲基联苯胺）溶液100L，37避光温育20min。4.3.2.6 终止反应 DB51/T 3014DB5
12、1/T 301420232023 6 每孔加入2M硫酸（H2SO4）50L终止反应，20min内用酶标仪测定结果。4.3.2.7 ELISA 检测结果判定 以空白孔调零，用酶标仪测定450nm的吸光值（OD450值），若阳性对照OD450值/阴性对照OD450值的比值大于2.1,则实验结果成立。P为待检血清孔OD450值，N为阴性对照孔OD450值，以P/N2.1判为阳性，P/N2.1判为阴性。疥螨病的 PCR 检测 4.4 4.4.1 材料的准备 4.4.2 试剂 1 TAE缓冲液（见附录F.1）；微量基因组DNA提取试剂盒；DL2000DNA Marker、灭菌ddH2O、2 Taq PC
13、R MasterMix II；GoldView II核酸染料。4.4.2.1 对照样品和待检样品 通过热源法从4.2.1.1采集的疥螨病病料中分离获得疥螨虫体，按微量基因组DNA提取试剂盒的说明书方法提取疥螨虫体的基因组DNA，从而获得疥螨DNA阳性对照样品。采用4.2.1.1方法采集病料获得待检样品。4.4.3 DNA 提取 将4.4.2.1的待检样品放入预冷的研钵中，加入液氮研磨成粉末，再用商品化的微量基因组DNA提取试剂盒的说明书方法提取DNA，获得的DNA立即进行后续PCR扩增或放入-20保存备用。4.4.4 PCR 扩增 扩增总体积为25L，包括PCR Mixture 12.5L，待
14、检样品DNA模板1.0L，上、下游引物各1.0L（10 pmol/L,引物序列5-GTGTGGAACTGGTAGAGG-3，5-CAGATCAAGCAAAAAGAGTT AAG-3），灭菌蒸馏水加至25.0L。同时设置疥螨DNA的阳性对照组和设置灭菌蒸馏水的阴性对照组。扩增条件如下：94 C预变性3min；94 C变性30s,54 C复性20s，72 C延伸20 s，35个循环；72 C延伸8min；8储存10min。产物预期大小为212bp。4.4.5 琼脂糖凝胶电泳和成像 4.4.5.1 制板 将1.6g琼脂糖放入8 mL1 TAE缓冲液中，加热融化，待温度降至56左右，加入GoldVie
15、w II核酸染料8L，倒入预先放置好的制胶台，插上梳子，厚度约3mm5mm。4.4.5.2 加样与电泳 取6L PCR产物（包括待检样品、阳性对照、阴性对照）及5L DL2000 DNA Marker加入凝胶孔内，经5V/cm电泳，电泳30min，于紫外凝胶成像仪或凝胶成像系统中观察结果，并拍照保存。4.4.6 PCR 检测结果判定 实验结果成立条件：当阳性对照出现212bp的特异性条带，且阴性对照未扩增条带。在实验结果成立的情况下，待检样品出现212bp的条带，则判定为疥螨核酸阳性（见附录F.2）。DB51/T 3014DB51/T 301420232023 7 若需要进一步确认检测结果，可
16、将电泳检测呈阳性的PCR剩余产物送公司进行测序，PCR扩增的疥螨COX1基因参考序列长212bp（见附录F.3）。综合判定 4.5 4.5.1 疑似患病动物 符合4.1.1或4.3.2.7阳性，判为疑似疥螨病；符合4.1.2或4.3.2.7阳性，判为疑似痒螨病；符合4.1.3，判为疑似足螨病。4.5.2 确诊患病动物 符合4.2.3.1或4.4.6阳性，判为疥螨病患病动物。符合4.2.3.2阳性，判为痒螨病患病动物。符合4.2.3.3阳性，判为足螨病患病动物。5 防治 预防 5.1 5.1.1 保持畜舍清洁干燥、通风、透光、不拥挤。5.1.2 新引进的家畜，严格执行落地隔离观察 15 天30 天，采用本文件中“4 诊断”规定的方法确诊无螨后方能合群。5.1.3 螨病常发地区，定期对家畜采用本文件中“4 诊断”规定的方法进行检查，一旦发现可疑家畜，立即隔离治疗，并使用外用杀虫药物对圈舍进行杀螨处理。5.1.4 养殖场严格使用药物进行定期驱虫。可选用伊维菌素、多拉菌素等药物，按药物生产厂家推荐的用量与用法规范使用。5.1.5 放牧家畜螨病的预防可在每年春、秋两季选用氰戊菊酯、双甲脒和二嗪农
