1、43湖南省地方标准ICSCCS 65.020.30B 43DB43/T 24122022 鸡冷冻精液制作技术规程Code of practice for making rooster frozen semen发 布湖南省市场监督管理局2022-07发布-02022-10实施-088DB43/T 24122022 I 目 次 前言 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和定义 1 4 准备 1 5 精液采集与品质检测 2 6 细管精液制作 2 7 细管精液冷冻 3 8 细管冷冻精液解冻及活力检测 3 9 细管冷冻精液保存及解冻应用 4 附录 A（资料性）主要器具与耗材 5 附录 B（规范
2、性）冷冻精液用液配制与保存 6 附录 C（资料性）精子密度估测方法示例 7 附录 D（资料性）精子活力评判方法 8 附录 E（资料性）液氮熏蒸法冷冻装置与细管铺放示例 9 附录 F（资料性）解冻精液应用及输精效果检测 10 参考文献 11 DB43/T 24122022 II DB43/T 24122022 III 前 言 本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由湖南省农业农村厅提出。本文件由湖南省农业标准化技术委员会归口。本文件起草单位：湖南省畜牧
3、兽医研究所、全国畜牧总站、浏阳市农业发展事务中心、湖南光大牧业科技有限公司、浏阳市湘依园生态农业有限公司、湖南陶氏生态禽业科技发展有限公司。本文件主要起草人：燕海峰、李安定、朱芳贤、宋武、白文娟、李闯、赵晓、张旭、刘伯承、黄璇、邓萍、伍国强、江为民、冯小花、文平、刘海林、朱斌、陶金彪。DB43/T 24122022 IV DB43/T 24122022 1 鸡冷冻精液制作技术规程 1 范围 本文件规定了鸡冷冻精液制作的准备、精液采集与品质检测、细管精液制作、细管精液冷冻、细管冷冻精液解冻及活力检测、细管冷冻精液保存及解冻应用。本文件适用于鸡细管冷冻精液的制作。2 规范性引用文件 下列文件中的内
4、容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 30396 牛冷冻精液包装、标签、储存和运输 NY/T 1234 牛冷冻精液生产技术规程 NY/T 3458 种鸡人工授精技术规程 NY/T 4047 家禽精液品质检测方法 3 术语和定义 NY/T 3458、NY/T 4047 界定的术语和定义适用于本文件。4 准备 4.1 器具与耗材 4.1.1 主要器具与耗材准备见附录 A。4.1.2 细管标示按 NY/T 1234 的规定执行，其中制作单位名称标示，采用习惯字
5、母、英文或者拼音首字母。4.1.3 重复使用的器具，使用后立即用清水浸泡。器具清洗和消毒操作按 NY/T 1234 与 NY/T 3458 的规定执行。4.1.4 细管、细管搓板、细管承载泡沫框等细管精液制作用具使用前置于 2 5 保温箱中，温度平衡后待用。4.1.5 水浴解冻保温箱中加入清洁自来水,水深大于 10 cm，放入冰袋或者冰块，保持水温为 2 5。4.2 用液 4.2.1 按照附录 B 配制所有用液。4.2.2 所有用液使用前置于 2 5 操作保温箱中，温度平衡后待用。4.2.3 所有用液与精液吸取前应摇匀。DB43/T 24122022 2 4.3 公鸡挑选与训练与训练 按 NY
6、/T 3458 规定执行。4.4 操作环境 4.4.1 操作环境应避免污染。4.4.2 冷冻精液制作室环境温度为 20 25。5 精液采集与品质检测 5.1 精液采集前准备 5.1.1 根据所采公鸡数量准备规格为 5 mL 的离心管。5.1.2 每只离心管中移入 0.2 mL 稀释液（I 液）。5.2 精液采集与稀释 5.2.1 手握加热已移入稀释液（I 液）的离心管，采用双人或单人背腹式按摩采精法采集精液，收集无污染、纯净精液，轻轻摇匀，置于 2 5 采精保温箱中。依次采集完所有公鸡精液，存于采精保温箱带回。5.2.2 在冷冻精液制作室外，将精液从采精保温箱中转移至 2 5 操作保温箱中。5
7、.2.3 自采集精液开始计时，宜在 30 min 时开始细管精液制作。如果远距离采集精液，采集后用稀释液（I 液）等比稀释，存放于 2 5 保温箱中尽快带回，应在精液采集后 4 h 内完成冷冻精液制作。5.3 精液品质检测 5.3.1 将显微镜温度设置在 32，按照 NY/T 4047 的方法检测精液品质。不同精子密度样品图示见附录 C。精子活力判定见附录 D。5.3.2 用于冷冻的精液应符合下列要求：a）精子密度不小于 15 亿个/mL；b）精子活力不低于 70或有效精子数不少于 10.5 亿个/mL。6 细管精液制作 6.1 液氮添加 至少在细管冷冻前 10 min，将液氮倒入细管熏蒸泡沫
8、箱等容器，液氮深度 3 cm4 cm。6.2 冷冻保护液添加 6.2.1 按照精子密度 7.5 亿个/mL、甘油最终浓度 6的冷冻精液制作要求，根据 5.3 检测的精子密度，选择甘油浓度适宜的冷冻保护液（II 液）并计算添加量。6.2.2 按计算量添加 2 5 的冷冻保护液（II 液），在 2 5 条件下平衡 10 min，准备灌装。6.3 精液灌装 6.3.1 人工灌装 DB43/T 24122022 3 6.3.1.1 握住细管精液棉塞端，另一端插入待灌装的精液中，分 2 次吸取精液，细管中间段留约 1 cm空气柱。6.3.1.2 擦干细管外壁残留液体，用热熔、超声波或封口粉封口，存放于
9、2 5 操作保温箱中。6.3.1.3 采用封口粉封口时，细管端含封口粉 2 mm，擦净细管外壁残留粉末。封口粉应根据需要量现取现用，防止污染。6.3.2 机械自动灌装 使用全自动细管精液灌装机灌装时，按操作说明书进行操作。7 细管精液冷冻 7.1 液氮熏蒸法 7.1.1 将厚度为 1 cm 的细管承载泡沫框套入细管搓板并置于搓板底部。7.1.2 以细管棉塞端指向操作者的方向，将细管铺放在细管搓板上。如需防止细管滑动或便于分组标记，则在细管棉塞端黏贴无纺布医用胶带形成细管带，胶带黏贴应既牢固，又利于浸入液氮后细管之间或胶带与细管间的剥离。7.1.3 平行抬起细管承载泡沫框，将细管从细管搓板整体转
10、移至细管承载泡沫框上。冷冻装置与细管铺放示例见附录E。7.1.4 将载有细管的细管承载泡沫框叠加于厚度为 3 cm5 cm 的泡沫框上，浮于已注入液氮的熏蒸泡沫箱液氮面上，细管带离液氮面距离 4 cm6 cm。盖上泡沫箱盖，静置 5 min 后将细管带迅速浸入液氮中。7.2 程序冷冻仪法 7.2.1 将细管架置于冷冻室，以-7/min 速率从 5 下降到-35，再以-60/min 速率从-35 下降到-140，于-140 停留 10 min，将细管立即浸入液氮中。7.2.2 其他操作按仪器操作说明书进行。8 细管冷冻精液解冻及活力检测 8.1 精液解冻 8.1.1 将冷冻细管精液从液氮中取出，
11、迅速浸入 2 5 水浴解冻泡沫箱中水浴 1 min3 min，取出擦干细管表面水分。解冻大批量细管精液时，应及时搅动细管，避免细管瞬间被冰包裹而影响解冻效果。8.1.2 剪掉封口端，用推针从棉塞端将精液推至规格为 2 mL 的离心管中。解冻大批量细管精液时，可同时剪掉多支细管棉塞端，使精液自然流出，并吹出管内余液。细管精液解冻后立即置于 2 5 保温箱中。8.2 精子活力检测 8.2.1 用于精子活力检测的细管冷冻精液，应已在液氮中保存 15 min 以上，精液解冻按 8.1 操作。8.2.2 按 5.3.1 检测精子活力，不低于 40为合格。DB43/T 24122022 4 9 细管冷冻精
12、液保存及解冻应用 9.1 每批次细管冷冻精液应按 10比例随机抽样，按 8.2 检测精子活力，抽检样品全部检测合格判定为批次检测合格。批次检测合格的冷冻精液继续保存，如细管上有胶带则应在液氮中将胶带去除。批次检测不合格的冷冻精液不再保存，进行无害化处理。9.2 合格冷冻精液的包装、标签、储存和运输应符合 GB/T 30396 的规定。9.3 解冻精液应用及输精效果检测见附录 F。DB43/T 24122022 5 附 录 A（资料性）主要器具与耗材 A.1 温度可调恒温显微镜（20 倍物镜）。A.2 程序冷冻仪。A.3 便携式低速冷冻离心机（10 mL,1000g,30 kg）。A.4 超低温
13、温度计（直径 0.5 mm T 型热电偶探头）。A.5 恒温干燥箱。A.6 细管搓板（长 17 cm、宽 9 cm、高 6 cm）。A.7 液氮罐 2 个（每个容量 10 L 以上）。A.8 长柄镊子 2 把、中柄镊子 2 把、剪刀 2 把、细管推针 2 根、插线板 2 个。A.9 自配稀释液设备：渗透压测定仪；酸度计；高压灭菌锅；超净工作台；磁力搅拌仪；石英蒸馏水器。A.10 液氮熏蒸法冷冻装置:液氮熏蒸泡沫箱，深不小于 25 cm，厚 4.5 cm，长、宽大于细管承载泡沫框；细管承载泡沫框，1 cm 厚 2 个，4 cm 厚 1 个，框外径 14.5 cm25.0 cm，厚 1.8 cm。
14、A.11 2 5 采精保温箱、操作保温箱。A.12 2 5 水浴解冻保温箱（长 30 cm、宽 30cm、高 20 cm）。A.13 0.25 mL 细管。A.14 封口粉。A.15 医用无纺布透气纸胶带、布胶带、拇指管、拇指管袋、棉线。A.16 标签纸，卫生纸，记号笔，冰袋。A.17 2 mL、5 mL、10 mL 离心管盒及相应离心管。A.18 10 L、200 L、1 mL 移液枪及相应枪头。A.19 载玻片、盖玻片。A.20 精液稀释液。A.21 液氮。DB43/T 24122022 6 附 录 B（规范性）冷冻精液用液配制与保存 B.1 稀释液（I 液）配方 稀释液（I 液）配方见表
15、 B.1。表 B.1 稀释液（I 液）配方 试剂中文名称 试剂英文名称或分子式 每100 mL稀释液（I液）用量 葡萄糖（一水）Glucose monohydrate 0.530 g 柠檬酸钾（一水）Potassium citrate tribasic monohydrate 0.102 g L-谷氨酸钠（一水）L-Sodium glutamate.H2O 1.210 g 乙酸鎂(四水)Magnesium acetate tetrahydrate 0.064 g BES（N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸）N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulp
16、honic acid 2.430 g 氢氧化钠 NaOH 0.185 g B.2 配制方法 B.2.1 稀释液（I 液）称取表 B.1 中试剂定容到 100 mL，稀释液（I 液）pH 为 7.1，渗透压为 320 mOsm/kg。B.2.2 冷冻保护液（II 液）B.2.2.1 12甘油冷冻保护液（12甘油 II 液）取稀释液（I 液）44 mL 加甘油 6 mL，磁力搅拌 30 min 以上。B.2.2.2 18甘油冷冻保护液（18甘油 II 液）取稀释液（I 液）41 ml 加甘油 9 mL，磁力搅拌 30 min 以上。B.2.3 清洗液（III 液）可直接使用稀释液（I 液），也可自配或购买专用清洗液。B.2.4 重悬液（IV 液）可直接使用稀释液（I 液），也可自配或购买专用重悬液。B.3 保存方法 2 5 或-20 以下保存。2 5 条件下保存不应超过 24 h，冷冻保存的用液解冻后不应二次冷冻。DB43/T 24122022 7 附 录 C（资料性）精子密度估测方法示例 精子密度估测方法示例见图 C.1。a）精子密度 40亿个/mL b）精子密度 20亿个/mL c）精
