1、I C S 6 7.1 0 0.1 0X 1 6付T中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 N Y/T 1 3 3 1-2 0 0 7乳与乳制品中嗜冷菌、需氧芽抱及嗜热需氧芽抱数的测定E n u m e r a t i o n o f C o l o n y o f P s y c h r o t r o p h i c Mi c r o o r g a n i s m s，T o t a l A e r o b i c B a c t e r i a l S p o r e s a n d T h e r mo p h i l i c A e r o b i cB a c t e
2、 r i a l S p o r e s i n Mi l k a n d D a i r y P r o d u c t s (I S 0 6 7 3 0:1 9 9 2 M i l k-E n u m e r a t i o n o f c o l o n y-f o r m i n g u n i t s o f p s y c h r o t r o p h i c m i c r o-o r g a n i s m s-c o l o n y-c o u n t t e c h n i q u e a t 6.5 C;N E N 6 8 1 3:1 9 9 9 M i l k a n
3、 d m il k p r o d u c t s -D e te r m i n a t io n o f t h e c o n t e n t o f s p o r e s o fm e s o p h i l i c a e r o b i c s p o r e f o r m i n g b a c t e r i a;N E N 6 8 0 9:1 9 9 9 M i l k a n d m i lk p r o d u c t s -D e t e r m i n a t i o n o f t h e c o-n t e n t o f t h e r m o p h i
4、l i c a e r o b i c s p o r e f o r m in g b a c t e r ia,N E Q)2 0 0 7-0 4-1 7发布2 0 0 7 一 0 7 一 0 1 实施费中华 人 民共和 国农 业部发 布N Y/T 1 3 3 1-2 0 0 7月 U青 本标准的 起草参考了I S 0 6 7 3 0:1 9 9 2 乳一嗜冷微生物菌落计数一6.5 菌落计数技术(英文版);荷兰国家标准N E N 6 8 1 3:1 9 9 9 乳与乳制品 一嗜中温需氧芽抱数的测定)(荷兰文版);荷兰国家标准N E N 6 8 0 9:1 9 9 9 乳与乳制品一嗜热需氧芽
5、抱数的测定(荷兰文版)。本标准与 I S 0 6 7 3 0:1 9 9 2,N E N 6 8 1 3:1 9 9 9,N E N 6 8 0 9:1 9 9 9的一致性程度为非等效。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位:农业部乳品质量监督检验测试中心。本标准主要起草人:李奇英、马文宏、张华、王金华。N Y/T 1 3 3 1-2 0 0 7乳与乳制品中嗜冷菌、需氧芽抱及嗜热需氧芽抱数的测定第一部分:乳中嗜冷菌数测定范围本部分规定了乳中嗜冷菌数的测定方法。本部分适用于生鲜乳及巴氏杀菌乳中嗜冷菌数的测定。2 规范性引用文件 下列文件中的条款通
6、过本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日 期的引用文件，其最新版本适用于本部分。G B/T 4 7 8 9.1 食品卫生微生物学检验 总则 G B/T 4 7 8 9.2 8-2 0 0 3 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂3 术语和定义 下列术语和定义适用于本部分。3.1 嗜 冷菌 p s y c h r o t r o p h i c m i c r o o r g a n i s m s 指在6.5 条件下，需氧培养 1
7、0 d，在MP C琼脂平板上形成可计数菌落的细菌、酵母和霉菌。3.2 MP C琼脂 m i l k p l a t e c o u n t a g a r 乳平板计数琼脂。4 原理检样在M P C 琼脂内，于6.5 条件下培养1 0 d，菌落计数，算出每毫升检样中的嗜冷菌数。5 稀释液和培养基5.1 蛋白膝一 盐溶液5.1.1 成分 酶水解酪蛋白 脉1.0 g 氯化钠8.5 g 蒸馏水1 0 0 0 M L5.1.2 制法 将酶水解酪蛋白 豚和氯化钠溶解于蒸馏水中，用质量分数 1 5%氢氧化钠溶液校正p H至7.0 士0.1。分装试管和烧瓶，每管9 M L、每瓶9 0 ML或2 2 5 mL，
8、相对误差不超过士2%。密封后，1 2 1 士i t高压灭菌1 5 m i n,5.25.3磷酸盐缓冲液:按G B/T 4 7 8 9-2 8-2 0 0 3 中3.2 2 规定进行制备。MP C琼脂培养基N Y/T 1 3 3 1-2 0 0 75.3.1 成分 胰蛋白 陈5.0 g 酵母浸膏2.5 9 葡萄糖1.0 g 脱脂奶粉1.0 g 琼脂1 0 g-1 5 g 蒸馏水1 0 0 0 M L 注1:脱脂奶粉不应含有抗生素类物质。注2:琼脂用量根据其凝固 程度决定。5.3.2 制法 将5.3.1 中除琼脂以外的各成分溶解于 蒸馏水中，用质量分数巧%氢氧化钠溶液校正p H至7.0 士0.1。
9、加人琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化。必要时使用两层纱布之间夹脱脂棉过滤，分装烧瓶。密封后，1 2 1 士I 高压灭菌 巧m i n。若立即使用此培养基，在水浴(6.3)中将其冷却到4 5 r-;否则，将灭菌后的培养基放于暗处温度为O U-5 之间贮存，时间不超过 3 0 d。为了避免延误倾注培养基的时间，微生物检测之前，加热融化培养基。然后，于水浴(6.3)中冷却到4 5 1C。6 设备和材料微生物实验室常用设备和材料。生化培养箱:6.5 士 0.5 C。水浴锅:4 5 士 I t。无菌培养皿:直径9 0 m m.无菌吸管。心.口乙0口叹U坟U月，民户0口U7 取样样品的 采取按G B/T 4 7
10、 8 9.1 执行。8 检测程序嗜冷菌数检测程序见图I .检样做成几个适当倍数的稀释液 选择三个适宜稀释度各取I M L 分别加人无菌 培养皿内每皿内加人 适量M P C 琼脂培养基 6.5 士 0.5 土 1 0 d菌落计数报告图 1N Y/T 1 3 3 1-2 0 0 79 操作步骤9.1 检样处理9.1.飞 快速翻转待检样品 容器2 5 次，使样品混合均匀，避免形成泡沫。然后，以无菌操作打开样品包装容器。9.1.2 用无菌吸 管(6.5)吸取1 M L 检样于含有9 M L 无菌稀释液(5.1 或5.2)的试管中(或t o M L 检样于含有9 0 ML无菌稀释液的烧瓶中，或2 5 m
11、 L检样于含有2 2 5 m l,无菌稀释液的烧瓶中)，经充分振摇获得 1 0 一 1 均匀稀释液。9.1.3 另用一支I M L 无菌吸管吸取t o-,稀释液1 M L，加人到含有9 M L无菌稀释液的试管中，振摇试管，混合均匀，获得1 0 一 2 稀释液。按上述操作方法，做1 0 倍递增稀释。如此每递增稀释一次，即 换用一支1 M L无菌吸管。9.2 接种及培养9.2.1 根据对样品中嗜冷菌污染情况的估计，选择三个适宜稀释度，分别在做 1 0倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移 1 M L该稀释液于无菌培养皿(6.4)内，每个稀释度接种两个培养皿。9.2.2 检查培养基(5.3)的温
12、度不要超过4 6 r-。然后，立即倾注1 2 m L-1 5 m L培养基到每个培养皿中。9.2.3 小心地转动培养皿使接种样液和培养基混合均匀，水平放置使混合物凝固。从第一步稀释液的制备到接种样液和培养基混合所用的时间不得超过1 5 m in,9.2.4 接种的同时，用I M L稀释液作空白试验。9.2.5 待琼脂凝固 后，堆叠培养皿，倒置在培养箱(6.2)中，于6.5 士 0.5 培养1 0 d.培养皿堆叠不超过 6 个。9.3 菌落计数9.3.1 做平板菌落计数时，可用肉眼观察，极微小的菌落也应计数在内，需要时用放大镜检查。9.3.2 蔓延的菌落被认为是单一菌落。如果被蔓延菌落所覆盖的部
13、分不到平板面积的1/4，计数未受影响的平板部分的菌落并计算出整个平板的相对量;如果被蔓延菌落所覆盖的部分超过了平板面积的1/4，不应计数。1 0 结果计算1 0.1 保留含有 1 0 个一3 0 0 个菌落的培养皿。用公式(1)计算每毫升样品中的嗜冷菌数:艺。(n i+0.l n 2+O.O l n 3)d(1)式 中:N样品中嗜冷菌数，c f u/m L;)III c 所 有 保留 培 养 皿中 计 数 菌 落 的 总 和;n i 保留的含有1 0 个一 3 0 0 个菌落的培养皿中 第一个稀释度的培养皿数;n 2 保留的含有1 0 个一 3 0 0 个菌落的培养皿中 第二个稀释度的培养皿数
14、;n 3 保留的含有1 0 个一 3 0 0 个菌落的培养皿中第三个稀释度的培养皿数;d 第一个稀释度的 稀释因数。结果保留两位有效数字。N Y/T 1 3 3 1-2 0 0 7示例:嗜冷菌的 菌落数给出 如下结果(每 个稀释 度培养 2 个 培养皿):在第一个稀释度下(t o 一 2)含有 1 6 8 个和2 1 5 个菌落;在第二个稀释度下(1 0-3)含有 1 4 个和2 5 个菌落;在第三个稀释度下(1 0 一 4)少于 1 0 个菌 落。艺。(n,+O.1 n 2+O.O t n 3)d1 6 8+2 1 5+1 4+2 5(2+0.1 x 2)X 1 0-2一4 2 2二 1 9
15、 1 8 2 U.U LL 修约上述结果，样品中 嗜冷菌数报告为1 9 0 0 0 或1.9 X 1 0 4 C f U/M L.1 0.2 如果所有稀释度培养皿中菌落数均少于1 0 个，结果报告为“样品中嗜冷菌数小于1 0 X 1 1 d c f u/r I IL II，式中d 为最低稀释液的 稀释度。1 0.3 如果所有稀释度培养皿中的菌落数均多于3 0 0个，从最接近3 0 0 个菌落的培养皿中计算出一个估计值乘以相应最高稀释度的倒数。结果报告为“每毫升样品中嗜冷菌数的估计值”。1 1 重复性 在重复性条件下两次独立测试结果的绝对差值，不大于较低结果的3 0%，以大于较低结果 3 0%的
16、情况不超过5%为前提。第二部分:需氧芽抱总数测定范围本部分规定了乳与乳制品中需氧芽抱总数的测定方法。本部分适用于生鲜乳及其制品中需氧芽抱总数的测定。2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日 期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日 期的引用文件，其最新版本适用于本部分。G B/T 4 7 8 9.1 食品卫生微生物学检验 总则 G B/T 4 7 8 9.2 8-2 0 0 3 食品 卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂3 术语和定义 下列术语和定义适用于本部分。3.1 需氧芽抱总数 t o t a l a e r o b ic b a c t e r i a l s p o r e s 指在有氧条件下，经8 0 加热处理1 0 m i n，能存活并且于3 6 下培养4 8 h 在MP C琼脂平板上形成可计数的菌落总数。3.2 MP C琼脂m i l k p la t e c o u n t a g a r 乳平板计数琼脂。4 原
