1、SN/T4090-2015前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准修改采用IS022119:2011食品和动物饲料微生物学实时PCR法检测食品致病菌的通用要求和定义制定，与IS022119相比，本标准做了如下修改：一对前言进行了修改，删去了引言部分；一对规范性引用文件的描述按照GB/T1.1的要求进行了修改；将标准中引用的国际标准用相应的国家标准或行业标准代替，如用SN/T2102.1代替IS022174;将标准中的3.9、3.10和3.11中的注释部分作为资料性附录分别放在了附录A、附录B和附录C中。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共
2、和国河南出入境检验检疫局。本标准主要起草人：苗丽、李轲、杨娜、钱成、郑皓、张巨洲、张子宏、王艳、王珊。SN/T4090-2015食源性病原微生物实时PCR检测通用要求1范围本标准规定了用聚合酶链式反应(PC)方法从食品中检测或分离食源性病原微生物的通用要求，也闸述了通过实时PCR扩增和检测核酸序列(DNA及RNA反转录后得到的cDNA)的要求。本标准中的最低要求是同一实验室的样品具有可重复性，不同实验室间的试验结果具有可比较性本标准适用于环境样品和动物饲料中食源性病原微生物的检测。注：由于该领域发展迅速，本标准中所举例子是标准起草阶段使用最频繁的案例。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是
3、必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T2102.1食源性病原体PCR检测技术规范第1部分：通用要求和定义SN/T2102.3食源性病原体PCR检测技术规范第3部分：定性检测方法样品制备的要求SN/T2102.4食源性病原体PCR检测技术规范第4部分：定性检测方法扩增和检测要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1实时聚合酶链式反应，即实时PCR Rea-time PCR在酶的参与下，特定的DNA序列通过变性、与特定引物的退火和延伸等一系列步骤完成体外扩增并实时监测PCR产物的过程。注1：
4、通常，扩增反应混合物中包含有一个或多个特异性的DNA探针。同时，这些探针结合有一种或多种荧光染料。运用这种技术，探针与靶核酸序列特异性杂交后，激发出具有一定波长的光，从而产生荧光信号。注2：对于用SN/T2102.4方法已经确认阳性结果的样品，可用非特异性DNA荧光染料进行检测3.2PCR产物PCR productPCR扩增出的DNA。3.3荧光共振能量转移(FRET)fluorescence resonance energy transfer运用PR检测食源性病原微生物时，在一定波长电磁辐射的激发下，能量从供体分子向受体分子转移，从而使受体分子的荧光强度提高。FRET程度与供、受体分子的空间
5、距离紧密相关。3.4报告基团reporter运用PCR检测食源性病原微生物时，在适当波长的电磁辐射的激发下，用于测定杂交过程中特异性探针的荧光分子。SN/T4090-20153.5淬灭基团quencher运用PCR检测食源性病原微生物时，充当能量受体，从而淬灭报道基团信号的荧光分子。3.6非荧光淬灭基团dark quencher发出的能量不在光谱范围内，不能通过PCR仪的光谱检测系统检测到的受体分子。3.75-3-核酸外切酶话性5-3-exonuclease activity有一类酶，如核酸聚合酶，具有将杂交的核酸分子沿5-3方向切开的功能。注：5-3-核酸外切酶的活性仅针对双链DNA结构，它
6、取决于酶的种类，可以出现在Tq聚合酶、Tth聚合酶和T1聚合酶中。3.8荧光探针fluorescent probe已知序列的寡核苷酸或类寡核苷酸与一个或多个荧光分子结合注：任何能够与靶核酸序列进行特异性杂交，并通过特殊的仪器检测到荧光信号的体系都可以作为荧光探针。3.9水解探针hydrolysis probe结合两个荧光分子的荧光探针在扩增过程中会被具有5-3外切酶活性的酶水解成单体。注：水解探针的原理示意图参见附录3.10杂交探针hybridization probe系统中的两个荧光探针分别结合一个荧光分子，其中一个分子作为供体，另一个作为受体。注：杂交探针的原理示意图参见附录B3.11分子
7、信标nolecular beacon荧光探针由三个部分组成：中心部分序列与靶基因序列互补两端的5端和3端序列互补、报告荧光基团和淬灭荧光基团分别结合在两端3.12检测特定病原体DNA序列的探针probe for detection of a specific pathogen DNA sequence探针序列与病原体DNA序列互补，携带一个报告荧光基团，能发出一定波长的信号，该信号能够被光学检测系统检测到。3.13用于检测内部控制核酸序列的探针probe for detection of an internal control nucleic acid sequence探针携带有一个能够确认扩增情况的报告基团。注1：该探针发出的荧光信号明显不同于检测特定病原体的探针荧光信号。注2：该应用要求所使用的仪器能够检测不同波长的信号。3.14参比荧光passive reference反应混合物中的用于校正信号的荧光分子。注：这些分子可以与核酸序列或其他分子结合而不参与反应。3.15荧光检测水平的基线baseline fluorescence detection level反应达到高于背景值的荧光强度。2
