1、ICS 11.080 C 50 WS 中华人民共和国卫生行业标准中华人民共和国卫生行业标准 WS/T 6502019 抗菌和抑菌效果评价方法 Evaluting Method for Efficacy of Antibacterial and Bacteriostasis 2019-01-30 发布 2019-07-01 实施 中华人民共和国国家卫生健康委员会 发布 WS/T 6502019 I 前 言 本标准按照GB/T1.1-2009的规定进行编写。本标准由江苏省疾病预防控制中心、中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所、山东省疾病预防控制中心、黑龙江省疾病预防控制中心负责起草。本标准
2、主要起草人：徐燕、谈智、张流波、陈越英、吴晓松、林玲、孙启华、崔树玉、赵华伟、吴克、张文生、王裕荣、吴晓、沈瑾、李炎、孙巍、王玲、王嵬、王晓蕾、褚宏亮。WS/T 6502019 1 抗菌和抑菌效果评价方法 1 范围 本标准规定了抗菌和抑菌评价方法的选择原则和使用。本标准适用于具有抗菌和(或)抑菌功能产品的抗菌、抑菌效果的鉴定。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 15979 一次性使用卫生用品卫生标准 FZ/T 73023 抗菌针织品 消毒技术规范（
3、2002版）卫生部（卫法监发2002282号）3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 抗菌 antibacterial 采用化学或物理方法杀灭或妨碍细菌生长繁殖，可减少其数量以及活性的过程。3.2 抑菌 bacteriostasis 采用化学或物理方法抑制或妨碍细菌生长繁殖及其活性的过程。3.3 持续抗菌作用 sustained antibacterial action 具有抗菌作用的消毒产品涂于物体表面，持续7d以上仍具有杀灭或妨碍细菌生长繁殖作用。3.4 中和剂 neutralizer 在杀灭微生物试验中，用以消除试验微生物与消毒剂的混悬液中，以及微生物表面上残留的消毒剂，使其
4、失去对微生物抑制和杀灭作用的试剂。4 评价方法的选择原则 WS/T 6502019 2 4.1 抗菌试验与抑菌试验区别 抗菌试验：测定抗菌产品对细菌和真菌的抗菌作用，试验过程中需要用中和剂终止杀菌作用。抑菌试验：测定抑菌产品对细菌和真菌的抑菌作用，试验过程中不需要使用中和剂终止抑菌作用。4.2 根据产品性能选择合适的评价方法 4.2.1 抑菌效果评价方法的选择原则 抑菌类产品选择抑菌效果评价方法。液体抑菌产品选择悬液定量抑菌试验，膏体或半固体凝胶类、黏稠状抑菌产品选择载体浸泡定量抑菌试验，湿巾类或其他自身含有抑菌成分的产品选择载体抑菌试验，肥皂类固体抑菌产品选择抑菌环试验，含有可溶性抑菌成分的
5、纺织品选择浸渍抑菌试验，含有持续抑菌作用的抑菌洗液选择滞留抑菌试验。4.2.2 抗菌效果评价方法的选择原则 抗菌类产品选择抗菌效果评价方法。液体抗菌产品选择悬液定量杀菌试验，凝胶状或膏状抗菌产品选择载体浸泡定量杀菌试验，湿巾类或其他自身含有抗菌成分的产品选择载体杀菌试验，含有可溶性抗菌成分的纺织品选择浸渍抗菌试验。含有不可溶抗菌成分的纺织品、无纺布、纤维等，经鉴别不含可溶性抗抑菌成分后，采用烧瓶振荡试验。含有不可溶抗菌成分的瓷砖、塑料、金属、涂料等，采用贴膜试验；对于涂于表面，干燥后具有持续抗菌作用的产品，进行持续抗菌试验。5 评价方法 5.1 抑菌效果 5.1.1 悬液定量抑菌试验 5.1.
6、1.1 适用范围 适用于液体抑菌制剂如卫生洗液、抑菌喷雾剂等对微生物抑菌效果的测定。5.1.1.2 试剂、培养基及器材 5.1.1.2.1 试验菌株 金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）、大肠杆菌（8099）、白色念珠菌（ATCC 10231）及根据抑菌剂特定用途所用的其他菌株。5.1.1.2.2 试剂 稀释液：0.03 mol/L 磷酸盐缓冲液（PBS）（pH7.27.4），培养基：金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的培养使用营养琼脂培养基，白色念珠菌的培养使用沙氏琼脂培养基。5.1.1.2.3 器材 恒温水浴箱、计时器、级生物安全柜等。5.1.1.3 试验步骤 WS/T 6502019 3 取试验菌
7、24h新鲜斜面培养物用PBS洗下，用PBS稀释至约5.0105 CFU/mL4.5106 CFU/mL菌悬液备用。取无菌试管，先加入5.0 mL样品（根据使用说明书要求使用原液或稀释液），置201 水浴中5min后，再加入0.1 mL试验用菌悬液，迅速混匀并立即计时。待试验菌与样品相互作用至说明书的规定时间，分别吸取1.0 mL试验菌与样品混合液接种2个平皿，倾注培养基。菌量无法计数时，以PBS做10倍系列稀释，选适宜稀释度分别吸取1.0 mL接种2个平皿，做活菌培养计数。同时用PBS代替样品，进行平行试验，作为阳性对照。阳性对照回收菌落数在1.0104 CFU/mL9.0104 CFU/mL
8、之间。取同批次PBS、培养基作阴性对照。所有试验样本和对照样本均在361培养，细菌繁殖体培养48h观察最终结果；白色念珠菌培养72h观察最终结果。试验重复3次，计算抑菌率。5.1.1.4 抑菌率计算%100010AAAX.(1)式中：X抑菌率，%；A0阳性对照组回收菌量，单位为 CFU/mL；A1试验组回收菌量，单位为 CFU/mL。5.1.1.5 结果判定 抑菌率50%90%，判有抑菌作用；抑菌率90%，判有较强抑菌作用。5.1.2 载体浸泡定量抑菌试验 5.1.2.1 适用范围 适用于膏体或半固体凝胶类、黏稠状抑菌产品对微生物抑菌效果的测定。5.1.2.2 试剂、培养基及器材 载体为10
9、mm10 mm脱脂白平纹布片，脱脂方法依照消毒技术规范（2002版）进行，使用前压力蒸汽灭菌备用，电子天平（d=0.01g），其它同5.1.1.2。5.1.2.3 操作步骤 取试验菌24h新鲜斜面培养物用PBS洗下，用PBS稀释至约5.0106 CFU/mL5.0107 CFU/mL制成菌悬液备用。用微量移液器滴染10 l菌悬液于灭菌载体上，361烘干或室温晾干备用。按5 g/片的量称取样品于无菌平皿内，置201水浴5min，用无菌镊子取染菌载体，使载体完全浸没于样品中，立即计时。待染菌载体与样品相互作用至说明书的规定时间，分别取染菌载体加入5.0 mLPBS试管中，混匀，振荡，将试验菌洗下，
10、分别吸取1.0 mL样液，按活菌培养计数方法测定存活菌数，每管样液接种2个平皿。如平板上生长的菌落数较多时，可用PBS进行10倍系列稀释后，再进行活菌培养计数。取10.0 g与试验样品同质材料不含抑菌成分的对照样品浸泡2片染菌载体进行平行试验，作为阳性对照。阳性对照回收菌量为1.0104 CFU/片9.0104 CFU/片。取同批次PBS、培养基作阴性对照。所有试验样本和对照样本均在361培养，细菌繁殖体培养48h观察结果；白色念珠菌培养72h观察结果。试验重复3次，计算抑菌率。5.1.2.4 抑菌率计算 WS/T 6502019 4%100010AAAX.(2)式中：X抑菌率，%；A0对照样
11、品的平均菌落数，单位为 CFU/片；A1被试样品平均菌落数，单位为 CFU/片。5.1.2.5 结果判定 抑菌率50%90%，判有抑菌作用；抑菌率90%，判有较强抑菌作用。5.1.3 载体抑菌试验 5.1.3.1 适用范围 适用于含溶出性抑菌成分的湿巾、无纺布口罩、卫生巾、护垫、尿布等固体类抑菌产品对微生物抑菌效果的测定。5.1.3.2 试剂、培养基及器材 见5.1.1.2。5.1.3.3 试验步骤 取试验菌24h新鲜斜面培养物用PBS洗下，用PBS稀释至约105 CFU/mL106 CFU/mL，制成菌悬液备用。用灭菌剪刀在无菌条件下将试验样品和对照样品分别剪成20 mm30 mm样片备用。
12、试验时滴加0.1 mL菌悬液。对照样片染菌前需经压力蒸汽灭菌。取无菌平皿，用无菌镊子取2片试验样片，勿重叠，置201水浴5min，在每一样片上滴加0.1 mL试验用菌悬液，立即计时。待试验菌与样片接触作用至说明书的规定时间，分别夹取染菌样片加于5.0 mLPBS试管中，混匀。振荡洗脱，分别吸取1.0 mL样液，按活菌培养计数方法测定存活菌数，每管样液接种2个平皿。如平板上生长的菌落数较多时，可10倍系列稀释后，再进行活菌培养计数。同时用与试验样品同质材料不含抑菌成分的对照样片2片代替试验样片进行试验，作为阳性对照，阳性对照回收菌量为1.0104 CFU/片9.0104 CFU/片；取同批次PB
13、S、培养基作阴性对照。所有试验样本和对照样本均在361培养，细菌繁殖体培养48h、白色念珠菌培养72h观察最终结果。试验重复3次，计算抑菌率。5.1.3.4 抑菌率计算 见式（2）。5.1.3.5 结果判定 抑菌率50%90%，判有抑菌作用；抑菌率90%，判有较强抑菌作用。5.1.4 抑菌环试验 5.1.4.1 适用范围 适用于含溶出性抑菌物质，可制成直径为5 mm片状物的固体抑菌产品的抑菌效果鉴定；也可用于鉴别抗抑菌样品中是否含有可溶性抑菌物质。WS/T 6502019 5 5.1.4.2 试剂、培养基及器材 游标卡尺，其它见5.1.1.2 5.1.4.3 试验步骤 将试验菌24h新鲜斜面培
14、养物用PBS洗下，稀释至5.0105 CFU/mL5.0106 CFU/mL备用。抑菌片的制备：溶出性固体抑菌产品，直接制成直径为5 mm，厚度不超过4 mm圆片（块），每4片为一组。阴性对照样片的制备：取同种材质不含抑菌成分的样本，制成与试验组大小相同的圆片（块）。用无菌棉拭子蘸取浓度为5.0105 CFU/mL5.0106 CFU/mL试验菌悬液，在适宜的培养基平板表面均匀涂抹3次。每涂抹1次，平板应转动60，最后将棉拭子绕平板边缘涂抹一周。盖好平皿，置室温干燥5min。每次试验贴放1个染菌平板，每个平板贴放4片试验样片，1 片阴性对照样片，共5片。用无菌镊子取样片贴放于平板表面，阴性对照
15、样片贴于平板中心位置，试验样片贴于四周，贴放好后，用无菌镊子轻压样片，使其紧贴于平板表面。各样片中心之间相距25 mm以上，与平板的周缘相距15 mm以上。盖好平板，置361培养16h18h观察结果，试验重复3次。用游标卡尺测量抑菌环的直径（包括贴片）并记录，测量抑菌环时，应选均匀而完全无菌生长的抑菌环进行，测量其直径应以抑菌环外沿为界。5.1.4.4 结果判定 阴性对照样片应无抑菌环产生，试验样品抑菌环直径7 mm者，判为有抑菌作用；抑菌环直径7 mm者，判为无抑菌作用。3次重复试验（共12个样片）均有抑菌作用，则判为合格。5.1.5 浸渍抑菌试验 5.1.5.1 适用范围 适用于溶出性抑菌
16、织物（如抑菌毛巾、口罩、内衣等）抑菌效果的测定。5.1.5.2 试剂、培养基及器材 5.1.5.2.1 试验菌株见 5.1.1.2.1 5.1.5.2.2 试样 在距试样布边10 cm以上、离布端1 m以上部位，剪取直径为5 cm的圆形试样若干，取3份试样分别装于3个锥形瓶中，盖好瓶口备用（需用试样数量要根据纤维类别及织物织法而定，以能吸收1 mL菌液且锥形瓶中不留残液为度）。另同法剪取与试样相同材质但不含抑菌剂对照织物若干，取2份分别装于2个锥形瓶中，盖好瓶口，121灭菌15min备用。5.1.5.2.3 试剂和培养基 0.03 mol/L PBS（pH7.27.4），肉汤培养基、营养琼脂培养基、沙氏培养基。5.1.5.2.4 菌悬液的制备 WS/T 6502019 6 用接种环将保存的菌种以划线法接种到营养琼脂平板，361培养24h，取典型的菌落移种到含肉汤培养基的锥形瓶中，361培养24 h，用肉汤对培养液进行系列稀释，使菌悬液的含菌量为1.0105 CFU/mL5.0105 CFU/mL。5.1.5.3 试验步骤 分别取1 mL菌悬液加入2份准备好的锥形瓶内试样和1份对照织物上
