1、1 15.1 细胞的衰老 Hayflick limitation 19611961年，年，Hayflick Hayflick 首次报道了体外培养的人成纤维首次报道了体外培养的人成纤维细胞细胞(human fibroblast)(human fibroblast)具有增殖分裂的极限。他利具有增殖分裂的极限。他利用来自胚胎和成体的成纤维细胞进行体外培养，发现用来自胚胎和成体的成纤维细胞进行体外培养，发现胚胎的成纤维细胞分裂传代胚胎的成纤维细胞分裂传代5050次后开始衰退和死亡，次后开始衰退和死亡，而来自成年组织的成纤维细胞只能培养而来自成年组织的成纤维细胞只能培养15153030代就开代就开始死亡
2、。始死亡。2 体外培养人的成纤维细胞，在体外分裂次数有限，证明细胞不是不死的 将老年的人的成纤维细胞与年轻的人的成纤维细胞同时培养，年轻状态的细胞在体外分裂次数更多，说明衰老与供体细胞的年纪有关 老年的人的成纤维细胞与年轻的人的成纤维细胞进行混合和单独培养比较实验，发现二者的分裂次数没有变化，说明与培养的环境无关 利用细胞杂交的方法确定引起衰老的真正原因。年轻的胞质体与年老的完整细胞融合，杂种细胞不能分裂；年老的胞质体与年轻的完整细胞融合，杂种细胞分裂能力与年轻相同，证明细胞核是导致衰老的真正原因 3 人类成纤维细胞离体培养人类成纤维细胞离体培养 早期早期 后期后期 4 早老症儿童与正常儿童的
3、比较早老症儿童与正常儿童的比较 5 1515.1 1.1 1 衰老细胞的特征衰老细胞的特征 6 细胞衰老的分子机理 （一）差错学派 1、代谢废物积累：如：脂褐质 2、自由基攻击：导致DNA、蛋白质变异，正常细胞内存在清除自由基的防御系统：酶系统：超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(CAT)，谷胱甘肽 过氧化物酶(GSH-PX)；非酶系统：维生素E，醌类等电子受体。7 遗传论学派 1、细胞有限分裂学说 “Hayflick”极限，即细胞最大分裂次数。L.Hayflick(1961)报道，人的成纤维细胞在体外培养时增殖次数是有限的（6070代）。细胞增殖次数与端粒DNA长度有关。2、重复基因失活学
4、说：如哺乳动物rRNA基因数随年龄而减少。8 3、衰老基因学说 子女的寿命与双亲的寿命有关；各种动物都有相当恒定的平均寿命和最高寿命；成人早衰症：平均39岁时出现衰老，47岁生命结束；婴幼儿早衰症：1岁时出现明显的衰老，1518岁生命结束，早衰症患者体内解旋酶发生突变。Caenrhabditis elegans的平均寿命仅3.5天，该虫age-1 单基因突变，可提高平均寿命65%，提高最大寿命110%。9 自由基攻击细胞的证据自由基攻击细胞的证据 10 15.2 程序性死亡PCD(program cell death)11 12 死亡 坏死 凋亡 15.2.1 简介 细胞坏死：是细胞受到急性强
5、力伤害时立即出现的反应。早期表现为细胞膜破坏，线粒体肿胀 继而溶酶体破裂,细胞内容物流出,引起炎症。13 2002年诺贝尔生理学或医学奖 英国科学家悉尼 布伦纳（Sydney Brenner）英国科学家约翰 苏尔斯顿（John E.Sulston）美国科学家罗伯特 霍维茨（H.Robert Horvitz）14 20022002年的诺贝尔生理学和医学奖授予了在器官发年的诺贝尔生理学和医学奖授予了在器官发育和程序性细胞死亡研究领域中做出奠基性贡献育和程序性细胞死亡研究领域中做出奠基性贡献的的3 3位科学家位科学家:英国的英国的BrennerBrenner、SulstonSulston和美国的和美
6、国的HorvitzHorvitz 他们创造性地用线虫作为实验模型他们创造性地用线虫作为实验模型,实现了对器官实现了对器官发育过程中细胞分裂发育过程中细胞分裂、分化的原位观察分化的原位观察,完成了细完成了细胞图谱的绘制胞图谱的绘制,在此基础上发现并研究了调控器官发育程序性细在此基础上发现并研究了调控器官发育程序性细胞死亡的关键基因及其功能并进一步在高等哺乳胞死亡的关键基因及其功能并进一步在高等哺乳动物中发现了相关功能基因动物中发现了相关功能基因。15 Kerr（1972）最先提出，与细胞坏死的区别是：细胞通过出芽的方式形成许多凋亡小体；凋亡小体内有结构完整的细胞器；不引起炎症；线粒体无明显形态变
7、化，溶酶体活性不增加；内切酶活化，DNA有控降解，凝胶电泳图谱呈梯状；凋亡通常是生理性变化，而细胞坏死是病理性变化。16 15.2.2 坏死与凋亡 17 PCD 18 坏死坏死 凋亡凋亡 19 DNA LADDER DNA LADDER 180200bp 转谷氨酰胺酶 tTG（tissue Transglutaminase）增加 生化特征生化特征 20 细胞凋亡和细胞坏死的区别 区别点 细胞凋亡 细胞坏死 起因 生理或病理性 病理性变化或剧烈损伤 范围 单个散在细胞 大片组织或成群细胞 细胞膜 保持完整，一直到形成凋亡小体 破损 染色质 凝聚在核膜下呈半月状 呈絮状 细胞器 无明显变化 肿胀、
8、内质网崩解 细胞体积 固缩变小 肿胀变大 凋亡小体 有，被邻近细胞或巨噬细胞吞噬 无，细胞自溶，残余碎片被巨噬细胞吞噬 基因组DNA 有控降解，电泳图谱呈梯状 随机降解，电泳图谱呈涂抹状 蛋白质合成 有 无 调节过程 受基因调控 被动进行 炎症反应 无，不释放细胞内容物 有，释放内容物。21 PCD PCD 调控神经细胞的数量调控神经细胞的数量 22 1.1.形态学形态学 23 2.电泳方法电泳方法 彗星电泳 24 3.DNA TUNEL3.DNA TUNEL 25 26 4.Caspase activity Western blot 27 28 5.流式细胞仪分析流式细胞仪分析 29 15.
9、2.4 揭开凋亡的机制 30 31 15.2.4.1 CED3/CASPASES Caspases:(cysteine asparic acic specific protease)Caspases 高度选择切割蛋白质，发生在少数结构域区域，高度选择切割蛋白质，发生在少数结构域区域，活化或者失活但不降解蛋白质活化或者失活但不降解蛋白质 32 Caspases Caspases2，8，9，10；take part in start PCD Caspases3，6，7；take part in perform PCD Caspases1，4，15；indirect function 33 Casp
10、ases 在哺乳动物中的调控 34 PCD gene in C.elegans C.elegans:Ced3 Ced4 Ced9 Human：ICE,apopain(死亡酶）,Apaf1 Bcl2 35 A 受体介导的程序性细胞死亡途径受体介导的程序性细胞死亡途径 36 NATURE REVIEWS|CANCER VOLUME 2|APRIL 2002|277 Death inducing signaling complex 37 Fas与配体（如TNF）结合发生三聚化，使胞内的DD 区（Death domain）与接头蛋白FADD的DD区结合。FADD N 端通过DED 区（death ef
11、fector domain）与Caspase-8前体结合，Caspase-8通过自剪接激活。Caspase-8引起caspase级联反应，激活Caspase-3、6、7。Caspase可降解结构蛋白、信号蛋白、转录调控蛋白、周期蛋白等等。38 胞外信号分子诱导的细胞凋亡途径小结 凋亡信号通路 当细胞接受凋亡信号分子(Fas,TNF等)后，凋亡细胞表面信号分子受体相互聚集并与细胞内的衔接蛋白(Adaptor protein)结合，这些衔接蛋白又募集Procaspases聚集在受体部位，Procaspase相互活化并产生级联反应，下游Caspases活化后使细胞凋亡。裂解核纤层蛋白，导致细胞核形成
12、凋亡小体；裂解DNase结合蛋白，使DNase释放，降解DNA形成DNA Ladder;裂解参与细胞连接或附着的骨架和其他蛋白，使凋亡细胞皱缩、脱落，便于细胞吞噬；致膜脂PS重排，便于吞噬细胞识别并吞噬。39 15.2.4.2 CED4/Apaf1 影响细胞凋亡蛋白质活性的因子 Apaf2就是细胞酶色素C 40 细胞内源信号激发细胞内源信号激发细胞程序性死亡细胞程序性死亡 Apoptosis protease activating factors Apaf2 C.elegans 41 15.2.4.3 Bcl-2家族与细胞凋亡 Bcl-2是一种原癌基因，是ced-9在哺乳类中的同源物，能抑制细
13、胞凋亡；与线粒体及内质网膜相结合；Bcl-2蛋白的羧基末端有一穿膜的结构域；Bcl-2家族成员的基因中，常常含有三个保守的Bcl-2同源区，即BH1，BH2和BH3 BclBcl-2 2基因蛋白表达可抑制多种组织细胞的凋亡基因蛋白表达可抑制多种组织细胞的凋亡，BclBcl-2 2蛋白是线粒体膜关联的稳定蛋白蛋白是线粒体膜关联的稳定蛋白，它主要位于线粒体外膜它主要位于线粒体外膜、核被膜和内质网膜核被膜和内质网膜。高浓度高浓度BclBcl-2 2蛋白抑制内质网中钙离蛋白抑制内质网中钙离子的释放子的释放 哺乳动物细胞中发现的Apaf2即是CytC Bcl-2、线粒体与细胞凋亡 42 Bcl-2对线粒
14、体功能的调控对线粒体功能的调控 抑制凋亡蛋白：抑制凋亡蛋白：Bcl-2、Bcl-XL、Mc15、Bfe1、A1。促凋亡蛋白：促凋亡蛋白：Bax、Bcl-XS、Bad、Bak、Bik等，分布在线粒体外膜、核膜和内质网等，分布在线粒体外膜、核膜和内质网膜上膜上 43 P53 肿瘤抑止基因，是人类肿瘤中突变最高的基肿瘤抑止基因，是人类肿瘤中突变最高的基因（因（50）P53肿瘤抑制基因分为野生型与突变型，野肿瘤抑制基因分为野生型与突变型，野生型生型P53诱导细胞凋亡，突变型诱导细胞凋亡，突变型P53抑制细胞抑制细胞凋亡凋亡 P53通过调节通过调节Bcl2 Bax的表达来影响细胞凋的表达来影响细胞凋亡亡
