1、第 3 期收稿日期:20220805基金项目:重庆市教育委员会应用技术研究项目(KJQN202001424);重庆市大学生创新创业计划训练项目:高产洛伐他汀功能红曲固态发酵工艺优化(S202110347032)作者简介:李林霞，女，本科生，生物工程专业。通信作者:吴鹏飞，讲师，主要研究方向为生物化工与工业发酵。添加有机酸对红曲发酵产洛伐他汀的影响李林霞，罗娅，王鸿，吴沣丽，吴鹏飞*(长江师范学院 生命科学与技术学院，重庆408100)摘要:探讨了添加六种不同有机酸(苹果酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸、草酸、醋酸)对红曲发酵产洛伐他汀的影响。首先采用 PlackettBurman 实验筛选出对红曲发酵
2、产洛伐他汀具有显著影响的三个因子，即柠檬酸、草酸、醋酸，然后通过 BoxBehnken 响应面实验确定产洛伐他汀的最佳工艺。研究结果表明:柠檬酸添加量为 186%，草酸添加量为 058%，醋酸添加量为 006%的条件下，洛伐他汀的含量为1135 mg/g。关键词:红曲;洛伐他汀;有机酸;响应面法中图分类号:TQ9206文献标识码:A文章编号:1008021X(2023)03000904Effects of Organic Acids Adding on Lovastatin Production by Monascus FermentationLi Linxia，Luo Ya，Wang Hon
3、g，Wu Fengli，Wu Pengfei*(College of Life Science and Technology，Yantze Normal University，Chongqing408100，China)Abstract:In this study，the effects of six different organic acids(malic acid，lactic acid，citric acid，succinic acid，oxalic acid andacetic acid)was investigated in lovastatin production by mon
4、ascus fermentationAt first，three factors that had significant influenceon lovastatin production were screened out by Plackett Burman test They were citric acid，oxalic acid and acetic acid，respectivelyThen，BoxBehnken response surface test was used to determine the optimal production process of lovast
5、atinTheresults showed that the content of lovastatin was 1135 mg/g when the addition amount of citric acid was 186%，oxalic acid was058%and acetic acid was 006%Key words:monascus;lovastatin;organic acids;response surface洛伐他汀是新一代的高效降血脂他汀类药物，随着对他汀类药物需求量的日益增加，红曲发酵产洛伐他汀在市场上有极大价值1。但红曲发酵生产过程中存在着产量低、生产周期长、生
6、产成本高等问题，在很大程度上限制了红曲产洛伐他汀的实际应用2。因此，如何提高红曲的发酵水平，降低生产成本，进而大幅提高洛伐他汀的产量，是目前红曲发酵面临的主要问题35。国内外关注红曲研究优化工艺基本都是从培养基的条件及原料的选择等方面进行，鲜少有在红曲发酵培养基中添加有机酸的，且大多只做了添加乳酸这一种有机酸的研究6。因此，本实验以红曲霉为实验菌种，选取六种属于发酵的中间产物的有机酸，探讨有机酸添加对红曲发酵产洛伐他汀的影响，并采用 PB 实验结合 BB 响应面实验确定有机酸添加后生产洛伐他汀的最佳工艺。本研究具有一定的实践和理论意义。1实验部分11材料红曲菌:实验室筛选红曲菌;大米:市售优质
7、籼米(湖南岳阳丝苗米);发酵袋:温州上骏塑料制品有限公司;马铃薯浸粉:南京全隆生物技术有限公司;蛋白胨:南京茂捷微生物科技有限公司;葡萄糖:天津科密欧试剂有限公司;玉米浆粉:成都市克隆化工试剂厂;硝酸钠:成都市克隆化工试剂厂;七水硫酸镁:重庆博艺化学试剂有限公司;苹果酸、乳酸:天津市大茂化学试剂厂;柠檬酸、琥珀酸、草酸、醋酸:西陇科学化工公司。12仪器与设备高效液相色谱仪:日本岛津 LC20A;恒温恒湿培养箱:上海跃进医疗器械有限公司;恒温振荡器、超净工作台:上海智诚分析仪器制造有限公司;自动压力蒸汽灭菌锅:致微仪器有限公司。13培养基固体 PDA 培养基:将马铃薯洗净削皮，称取 200 g
8、切碎后入锅，加水 1 L 并煮至马铃薯熟而不烂，沸水中加入 15 g 葡萄糖和 15 20 g 琼脂，溶解后立即用纱布过滤，121 灭菌20 min。种子培养基:60 g/L 葡萄糖，25 g/L 蛋白胨，1 g/L 七水硫酸镁，10 g/L 玉米浆粉，2 g/L 硝酸钠，1 g/L 磷酸氢二钾，pH 自然，按比例称重后加水溶解并分装至锥形瓶中，115 灭菌15 min。14菌种培养与固态发酵菌种培养:冷冻保存的红曲菌孢子液均匀涂布于 PDA 平板上，并在 30 条件下培养 2448 h，获得单菌落。从平板上选取丰满的单个中型白色菌落，用接种针挑取接种于液体培养基里，30 下 180 r/mi
9、n 振荡培养 48 h。固态发酵:电子天平称取 200 g 籼米，清水洗涤后控去多余水分，并补水至 300 g。将米水混合物转移至干净的培养袋中，121 灭菌 30 min。无菌条件下每袋接种 30 mL 红曲种子液，并添加有机酸，32 培养两天后 28 培养 19 d。发酵结束后采用高效液相色谱法(HPLC)检测红曲菌固态发酵所产代谢物中洛伐他汀的含量7。15PB 实验设计应用 DesignExpert 805 软件开展 PlackettBurman 设计，对苹果酸添加(A)、乳酸添加(B)、柠檬酸添加(C)、琥珀酸添加9李林霞，等:添加有机酸对红曲发酵产洛伐他汀的影响DOI:10.1931
10、9/ki.issn.1008-021x.2023.03.002山东化工(D)、草酸(E)、醋酸添加(F)等 6 个实验因素进行考察，每个要素设计高和低两个等级(1 和1)，并以发酵结束后红曲米中洛伐他汀的含量作为考察指标。PB 实验设计因素及水平如表 1所示。表 1PB 实验设计因素及水平符号因子低水平/%高水平/%A苹果酸0525B乳酸0530C柠檬酸0525D琥珀酸0525E草酸01F醋酸01G虚拟因素 100H虚拟因素 200I虚拟因素 30016响应面实验设计在 PB 实验结果的基础上，根据 BoxBehnken 响应面实验设计原理，以红曲米中洛伐他汀含量为响应值，培养温度、接种量、初
11、始含水量为自变量，采用 DesignExpert 805 软件设计响应面优化实验，设计因素和水平如表 2 所示。表 2响应面法分析因素及水平水平因素C 柠檬酸添加量/%E 草酸添加量/%F 醋酸添加量/%10500015050512510102结果与分析21PB 实验设计结果按照 PB 实验设计，在不同的添加条件下进行实验，结果如表 3 所示。表 3PB 实验设计及结果实验号A 苹果酸B 乳酸C 柠檬酸D 琥珀酸E 草酸F 醋酸Y 洛伐他汀含量/(mgg1)111111153621111115933111111721411111160251111114946111111409711111164
12、3811111160591111111007101111117811111111175312111111835以洛伐他汀含量为考察指标，用 DesignExpert 805 软件对实验数据进行处理，分析各因素的显著性，结果见表 4。由表4 可知，醋酸添加量对洛伐他汀含量影响极显著(P001)，柠檬酸添加量、草酸添加量对洛伐他汀含量影响显著(P005)，苹果酸添加量、乳酸添加量、琥珀酸添加量对洛伐他汀含量影响不显著，显著性大小依次为醋酸添加量草酸添加量柠檬酸添加量苹果酸添加量琥珀酸添加量乳酸添加量。因此选择具有显著影响的 3 个因素，柠檬酸添加量(C)、草酸添加量(E)、醋酸添加量(F)作为下一
13、步响应面模型的考察因素。表 4PB 模型分析结果因子F 值P 值重要性排序A4140097 44B0990366 06C7060045 13D1920224 65E7410041 62F21770005 5122响应面优化结果221响应面实验结果根据 Design Expert 805 软件对 PB 筛选实验得到的三个因素，分别为柠檬酸添加量、草酸添加量、醋酸添加量进行实验设计，根据设计表开展实验，将所得到的洛伐他汀的含量填入表中，BoxBehnken 实验结果如表 5 所示。表 5BoxBehnken 实验设计及结果实验号C 柠檬酸E 草酸F 醋酸Y 洛伐他汀含量/(mgg1)1110978
14、21109563110929411091551011087610111017101871810186390111132100111014110118391201182601SHANDONG CHEMICAL INDUSTY2023 年第 52 卷第 3 期表 5(续)实验号C 柠檬酸E 草酸F 醋酸Y 洛伐他汀含量/(mgg1)13000108114000108315000109160001085170001096180001098对表 5 中的数据进行方差分析，得到以洛伐他汀含量(Y)为因变量，柠檬酸添加量(C)、草酸添加量(E)、醋酸添加量(F)为自变量的二次项多元回归方程如下:Y=108
15、90038C028E117F+0020CE0055CF+026EF058C2086E2050F2响应面结果回归分析表见表 6。从表中可知，该二次方程模型 P001，说明该模型极显著，且失拟项 P=0104 4005，表明该模型失拟不显著，具备统计学意义。其中，回归方程的决定系数 2Adj=0991 4，说明该模型能够解释 9914%的洛伐他汀含量的变化情况;模型变异系数(离散系数)CV=098%10%，进一步说明该模型稳定性好，重复性好;频率稳定度(AdeqPrecision)为 395584，说明该模型具备较高的精度和较强的回应数据信号，可以很好地体现实验结果。总而言之，回归方程模型可以很好
16、地预测分析添加不同有机酸后红曲米成品中的洛伐他汀含量。表 6响应面回归方程方差分析项目平方和df均方F 值P 值模型18849209217890000 1C0011100111170310 73E061106163550000 1F1093110931 137449 8540000 1CE1600103116001030170693 9CF0012100121260294 3EF028102828690000 7C21481148154330000 1E23231323336250000 1F21091109113740000 1残差007789607103失拟项0052300173520104 4误差002554937103总和189217222响应曲面交互分析通过 DesignExpert805 软件得到柠檬酸添加量(C)、草酸添加量(E)、醋酸添加量(F)3 种因子两两相互作用对洛伐他汀含量的影响的响应面和等值线图，结果见图 1。综合分析表 6和图 1 可知，柠檬酸添加量(C)、草酸添加量(E)、醋酸添加量(F)3 种因子对洛伐他汀含量的影响程度大小排序:醋酸添加量(F)草酸添加
