1、第 卷第 期 年 月江 苏 大 学 学 报(医 学 版)().蛋白乳酸化促进结肠癌细胞增殖和转移戴瑶 戴海燕 笪文信 王雅卉 张子琦 王胜军 马洁(.江苏大学医学院江苏 镇江 .江苏大学附属第四人民医院检验科江苏 镇江)摘要 目的:探讨 蛋白乳酸化修饰对结肠癌细胞增殖、转移的影响及其机制 方法:收集人结肠癌组织和相应癌旁组织经 染色确认病理形态后通过乳酸测定试剂盒检测组织与结肠癌细胞 乳酸浓度免疫组织化学染色法检测组织乳酸化水平和 表达水平 免疫荧光染色法观察结肠癌组织中的乳酸化和 蛋白定位免疫共沉淀检测组织与 细胞中 蛋白的乳酸化水平 蛋白印迹法检测 细胞中 蛋白的亚细胞定位 在内源性乳酸介
2、导 细胞的 蛋白乳酸化修饰以及乳酸抑制剂草氨酸钠抑制 蛋白乳酸化修饰后采用 法检测 细胞的增殖能力划痕实验和 法检测 细胞的迁移和侵袭能力 结果:人结肠癌组织中乳酸化水平和 表达水平均高于癌旁组织并且存在明显的 蛋白乳酸化修饰内源性乳酸介导 细胞中 蛋白乳酸化修饰后在抑制 入核的同时促进细胞的增殖、侵袭和迁移 结论:乳酸化 蛋白通过抑制 的入核促进结肠癌细胞的增殖和转移关键词 乳酸化修饰 蛋白结肠癌增殖转移中图分类号 文献标志码 文章编号 ():./.引用格式戴瑶戴海燕笪文信等.蛋白乳酸化促进结肠癌细胞增殖和转移.江苏大学学报(医学版)():.基金项目国家自然科学基金面上项目()江苏省重点研发
3、计划社会发展项目()镇江市重点研发计划(社会发展)项目()江苏大学临床医学科技发展基金()作者简介戴瑶()女硕士研究生马洁(通讯作者)教授硕士生导师:.(.):.:.:.:.结直肠癌是世界上第四大致命癌症每年造成近 万人死亡其中结肠癌占近 是结直肠癌中基因守护者参与多种细胞反应在肿瘤发展转移中发挥重要作用 基因针对不同的应激反应 发生多种翻译后修饰这些修饰在特定的生物环境中精确调控其不同的生物功能肿瘤细胞即使在氧气存在的情况下也会优先选择无氧糖酵解途径并产生乳酸 随着肿瘤代谢学科的发展越来越多的研究证明乳酸对肿瘤进展和转移至关重要 在肾癌、胰腺癌和前列腺癌中乳酸会增强癌细胞侵袭和迁移的能力 最
4、近研究证实乳酸能够介导组蛋白乳酸化在肿瘤相关免疫细胞中调控基因的转录从而帮助肿瘤细胞实现免疫逃逸 事实上乳酸化修饰广泛存在于人类蛋白质组中且主要存在于非组蛋白赖氨酸上目前非组蛋白乳酸化修饰在结肠癌发生转移作用的研究极少 因此本研究将对结肠癌中 的乳酸化修饰进行研究并探究 乳酸化促进癌细胞增殖、转移的机制为表观遗传修饰促进结肠癌发展的研究提供一种新的思路 材料与方法.材料.组织样本、细胞株 例结肠癌组织样本来自江苏大学附属第四人民医院(均经病理科确诊)术前未经任何治疗并保留完整的临床资料 以上研究均得到江苏大学附属第四人民医院伦理委员会批准并取得患者知情同意 人结肠癌细胞系 购自武汉普诺赛生命科
5、技有限公司.主要试剂低糖、高糖、胎牛血清(美国 公司)胰酶、试剂、曝光液、免疫组织化学试剂盒、即用型、即用型结晶紫(白鲨公司)兔抗人肌动蛋白抗体(武汉三鹰生物技术有限公司)小鼠抗人 抗体、蛋白/琼脂糖(美国 公司)兔抗人乳酸化修饰抗体(景杰生物公司)标记的羊抗兔/小鼠二抗、标记兔、山羊抗小鼠(武汉博士德生物公司)草氨酸钠(上海麦克林公司)基质胶(上海诺娃医药科技有限公司)小室(美国 公司)裂解液、蛋白预染分子量标准(上海雅酶生物医药科技有限公司)胞质胞核分离试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)乳酸测试盒(南京建成公司).方法.细胞培养 细胞培养于含 胎牛血清的高糖 中在 、的培养箱中进行培养与
6、传代.免疫组织化学染色法检测结肠癌组织中乳酸化水平和 的表达水平 结肠癌组织样本经甲醛固定过夜石蜡包埋后连续切片进行脱蜡处理 浸洗 次于高温柠檬酸盐缓冲液中进行抗原修复过氧化氢封闭内源性过氧化物酶加入小鼠抗人 抗体()或兔抗人乳酸化修饰抗体()于 孵育过夜次日弃液体 浸洗 次加入生物素化二抗室温孵育 试剂 孵育 加入 显色液苏木精复染、脱蜡、水化、中性树脂封片、自动扫描机进行图像采集.免疫荧光染色法检测结肠癌组织和 细胞中乳酸化和 定位 用 多聚甲醛固定结肠癌组织切片和 细胞过夜弃多聚甲醛液体 浸洗 次加入.室温 弃去液体 浸洗 次加入小牛血清室温封闭 弃去液体 浸洗 次加入小鼠抗人 抗体()
7、和兔抗人乳酸化修饰抗体()于 孵育过夜次日弃去液体 浸洗 次加入 标记兔 和 山羊抗小鼠()室温孵育 弃去液体 浸洗次加入即用型 室温孵育 弃去液体 浸洗 次晾干封片镜检拍照.免疫共沉淀法()检测 蛋白乳酸化水平预冷 浸洗细胞或组织 遍 裂解液冰上裂解细胞或组织 用刮刀轻轻刮下细胞或超声碎组织得到细胞或组织裂解液将裂解液装入.离心管中冰上裂解 每隔 振荡 次 /离心 取上清液装入新的预冷的.离心管中分出一部分蛋白裂解液作为全细胞裂解液组向剩余的蛋白裂解液中加入 小鼠抗人 抗体 缓慢摇 加入预先用 裂解液清洗过的蛋白/琼脂糖于 缓慢摇 /离心 弃上清液加入 裂解液洗涤重复操作 次最后加入一定量
8、裂解液得到 组与全细胞裂解液组一起加入对应量 蛋白质缓冲液 煮沸 后可进行后续蛋白印迹实验 蛋白上样后以 电压电泳 待分子 进入分离胶后将电压转为 溴酚蓝的位置快到胶底时停止电泳 江苏大学学报(医学版)第 卷 转膜 将蛋白转至 膜脱脂奶粉封闭 加入相应一抗 孵育过夜 清洗条带 次每次 将膜室温孵育在稀释好的二抗中室温摇床孵育 采用化学发光法检测抗体结合用 软件对显影得到的黑白条带图进行灰度值扫描分析.蛋白质印迹法检测结肠癌细胞中 蛋白表达及亚细胞分布情况用预冷 浸洗细胞 遍用细胞刮子轻轻刮下细胞每 细胞沉淀加入 添加了 的细胞质蛋白抽提试剂 剧烈振荡 冰上裂解 加入细胞质蛋白抽提试剂 剧烈振荡
9、 /离心 得到的上清液即为细胞质蛋白裂解液对于沉淀完全吸尽残余的上清液加入 添加了 的细胞核蛋白抽提试剂剧烈振荡 然后放回冰上每隔 剧烈振荡 共 /离心 得到的上清液即为细胞核蛋白裂解液向细胞核、细胞质蛋白裂解液中加入对应量 蛋白缓冲液 煮沸 后可进行蛋白印迹实验.法检测结肠癌细胞增殖能力消化并重悬细胞在 孔板中每孔分别加入 个细胞每组设计 个复孔 后加入不同的药物处理在、和 时间点弃培养基 浸洗 遍加入含 试剂的培养基 孵育 后用酶标仪在 处测定光密度()值.划痕实验检测结肠癌细胞迁移能力消化并重悬细胞在 孔板中每孔加入 个细胞 培养 使其融合度达 左右用 无菌枪头在每孔细胞上均匀地划 条竖
10、线弃培养基 浸洗 遍加入含 胎牛血清的不同条件培养基 培养在 和 时间点镜检拍照.法检测结肠癌细胞迁移能力将 细胞分成 组分别用低糖(葡萄糖浓度为/)、高糖(葡萄糖浓度为 /)和高糖 乳酸脱氢酶 抑制剂草氨酸钠()处理细胞 消化并用无血清培养基重悬细胞计数 个细胞种于小室上室小室下室中加入 含 胎牛血清的培养基、培养 弃培养基用棉签轻轻擦掉上室细胞用多聚甲醛固定 浸洗 遍即用型结晶紫室温染色 浸洗 遍于显微镜下 倍观察拍照.基质胶小室检测结肠癌细胞侵袭能力将基质胶与无血清培养基按 比例稀释每个小室上室加入 稀释后的基质胶溶液 放置 分别用低糖培养基、高糖培养基和草氨酸钠条件培养基预处理细胞 消
11、化并用无血清培养基重悬细胞计数 个细胞种于小室上室小室下室中加入 含 胎牛血清的培养基、培养 弃培养基用棉签轻轻擦去上室细胞用 多聚甲醛固定 浸洗 遍即用型结晶紫室温染色 浸洗 遍于显微镜下 倍观察拍照.乳酸试剂盒检测乳酸浓度 取等量组织或等数量细胞预冷 清洗 遍用 裂解液冰上裂解 预冷刮刀轻轻刮下细胞装入.离心管中 /离心 取上清液按乳酸试剂盒说明书操作.统计学分析应用 .软件分析实验数据并制图 计量数据以均值 标准差()表示两组间比较采用独立样本 检验多组间均数比较采用单因素方差分析进一步两两比较采用 检验随机区组间均数比较采用双因素方差分析.为差异有统计学意义 结果.结肠癌组织中乳酸浓度
12、、乳酸化水平和 的表达水平均显著增高与癌旁组织相比结肠癌组织中出现腺体结构紊乱、癌细胞核异位等癌变现象 结肠癌患者肿瘤组织中的乳酸浓度明显高于癌旁组织(.)说明糖酵解是结肠癌细胞主要的糖代谢途径 与对应癌旁组织相比肿瘤组织中 的表达水平和乳酸化水平明显增高提示乳酸、乳酸化与 蛋白可能存在一定的联系见图.结肠癌组织存在 蛋白乳酸化修饰与对应癌旁组织相比结肠癌组织中 蛋白水平和乳酸化水平均增高并且存在共定位现象临床组织标本中 位结肠癌患者中有 位患者肿瘤组织中乳酸化水平明显增高其中 位患者肿瘤组织中 蛋白水平和 蛋白乳酸化水平均高于对应的癌旁组织见图.结肠癌细胞系 中存在 蛋白乳酸化修饰接着探究结
13、肠癌细胞系中是否也存在 蛋白乳酸化修饰选用 高表达的 细胞进第 期戴瑶等.蛋白乳酸化促进结肠癌细胞增殖和转移行后续研究 与低糖条件组相比高糖条件组 细胞内乳酸浓度明显增高(.)与高糖条件组相比 抑制剂组 细胞内乳酸浓度明显降低(.)说明 抑制剂能够有效抑制细胞内的乳酸生产与低糖条件组相比高糖条件组 细胞中 蛋白乳酸化水平较高与高糖条件组相比 抑制剂组 蛋白乳酸化水平较低 由此得出结论乳酸能够介导结肠癌细胞中 蛋白发生乳酸化修饰见图:结肠癌组织 染色结果:不同组织中乳酸浓度比较:免疫组化检测结肠癌组织中乳酸化水平和 表达水平图 结肠癌组织 染色及其乳酸浓度、乳酸化水平和 表达水平的检测:免疫荧光
14、检测结肠癌组织中乳酸化和 定位:免疫共沉淀检测结肠癌组织中 蛋白乳酸化水平(为癌旁组织 为结肠癌组织):位结肠癌患者图 结肠癌组织存在 蛋白乳酸化修饰:结肠癌细胞中乳酸浓度:免疫共沉淀检测结肠癌细胞中 乳酸化水平:免疫共沉淀检测结肠癌细胞中 乳酸化水平图 结肠癌细胞 中存在 乳酸化修饰.蛋白乳酸化修饰促进结肠癌细胞 的增殖、迁移和侵袭划痕实验结果显示与低糖条件组相比高糖条件组 细胞在 时伤口愈合率明显增高(.)与高糖条件组相比 抑制剂组 细胞在 时伤口愈合率明显降低(.)由此推断 蛋白乳酸化修饰促进结肠癌细胞的转移 迁移实验结果显示 江苏大学学报(医学版)第 卷与低糖条件组相比高糖条件组 细胞
15、在 时迁移细胞数量明显增多()与高糖条件组相比 抑制剂组 细胞在 时迁移细胞数量明显减少()侵袭实验结果显示与低糖条件组相比高糖条件组 细胞在 时侵袭细胞数量显著增多(.)与高糖条件组相比 抑制剂组 细胞在 时侵袭细胞数量显著减少()以上说明在 蛋白乳酸化高表达条件下结肠癌细胞的迁移和侵袭能力显著增强 细胞增殖实验结果显示低糖条件组与 抑制剂组细胞增殖能力降低而高糖条件组细胞增殖能力增强 综上说明结肠癌细胞内乳酸化促进细胞的增殖和转移见图:划痕实验检测结肠癌细胞迁移能力:法检测结肠癌细胞迁移能力:基质胶法检测结肠癌细胞侵袭能力:法检测结肠癌细胞增殖、:癌细胞的迁移及侵袭能力定量分析:/葡萄糖:
16、/葡萄糖:/葡萄糖 /草氨酸钠图 乳酸化肠癌细胞 的增殖、迁移和侵袭的影响.乳酸化改变 细胞中 蛋白的亚细胞定位免疫荧光结果显示低糖条件组细胞中乳酸化和 蛋白集中在细胞核内高糖条件组细胞乳酸化和 蛋白多位于细胞质 抑制剂组乳酸化和 蛋白多位于细胞核中 将细胞蛋白进行核质分离与低糖条件组相比高糖条件组细胞内 蛋白在细胞质内明显增多()而在细胞核内明显减少()与高糖条件组相比 抑制剂组细胞内 蛋白在细胞核内明显增多()而在细胞质内明显减少(.)由此说明 蛋白乳酸化促进结肠癌细胞增殖和转移的机制可能是减少 蛋白在细胞核中的表达从而降低其作为抑癌转录因子的功能最终达到促进肿瘤发展和转移的目的见图 第 期戴瑶等.蛋白乳酸化促进结肠癌细胞增殖和转移:免疫荧光观察结肠癌细胞中 和乳酸化定位:胞核与胞质分离后免疫印迹检测结肠癌细胞中 亚细胞表达:核质分离后免疫印迹检测结肠癌细胞中 亚细胞表达图 乳酸化对结肠癌细胞中 亚细胞定位的影响 讨论结直肠癌约占全球每年诊断的癌症和癌症相关死亡总数的 转录因子 是一种重要的肿瘤抑制因子它调节不同的细胞反应以抑制癌症的发展 的功能丰富多样能够参与并影响 修复、细胞周
