1、2022年版微生物限度检查年版微生物限度检查法法 增修订内容简介增修订内容简介 以?中国药典?一部为例 2022.10 一、增加的内容一、增加的内容 1、增加了贴剂、增加了贴剂 的微生物检查方法的微生物检查方法 检查方法：检查方法：取规定量供试品，去掉贴剂的保护层，放置在无取规定量供试品，去掉贴剂的保护层，放置在无菌玻璃或塑料片上，粘贴面朝上。用适宜的无菌菌玻璃或塑料片上，粘贴面朝上。用适宜的无菌多孔材料多孔材料如无菌纱布如无菌纱布覆盖贴剂的粘贴面以防覆盖贴剂的粘贴面以防止贴剂粘贴在一起。然后将其置于适宜体积并含止贴剂粘贴在一起。然后将其置于适宜体积并含有灭活剂有灭活剂如聚山梨酯如聚山梨酯80
2、或卵磷脂或卵磷脂的稀释剂中，的稀释剂中，用力振荡至少用力振荡至少30分钟，或以其他方法制备成供试分钟，或以其他方法制备成供试液。贴膏剂应采用薄膜过滤法进行细菌、霉菌及液。贴膏剂应采用薄膜过滤法进行细菌、霉菌及酵母菌计数。酵母菌计数。2、增加了计数培养基的适用性检查增加了计数培养基的适用性检查 细菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基应进行培养基的适用性检查，包括成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配制的培养基均应检查。2、增加了计数培养基的适用性检查增加了计数培养基的适用性检查 适用性检查：适用性检查：取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各孢杆菌各50100
3、cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注，分别注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，个平皿，混匀，凝固，置凝固，置3035培养培养48hr，计数；取白色念珠菌、黑，计数；取白色念珠菌、黑曲霉各曲霉各50100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注玫，分别注入无菌平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，个平皿，混匀，凝固，置凝固，置2025培养培养72hr，计数；取白色念珠菌，计数；取白色念珠菌50100cfu，注入无菌平皿中，立即倾注酵母浸出粉胨葡萄，注入无菌平皿中
4、，立即倾注酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，平行制备糖琼脂培养基，平行制备2个平皿，混匀，凝固，置个平皿，混匀，凝固，置2025培养培养72hr，计数。同时，用对应的对照培养基替代，计数。同时，用对应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。被检培养基进行上述试验。2、增加了计数培养基的适用性检查增加了计数培养基的适用性检查 结果判定结果判定：被检培养基的菌落数与对照培：被检培养基的菌落数与对照培养基菌落数相比大于养基菌落数相比大于70%，且菌落形态大，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。判该培小应与对照培养基上的菌落一致。判该培养基的适用性检查符合规定。养基的适用性检查符合规定。3、增加了菌
5、液使用时间的有关规定 菌悬液制备后应在2小时内使用，假设保存在28的菌悬液可以在24小时内使用。黑曲霉也可制成稳定的孢子悬液保存在28，在验证过的贮存期内替代对应量的新鲜孢子悬液使用。4、删除了离心沉淀集菌法 原因：由三个所组成的课题组进行了离心沉淀集菌法 的标准化研究，结果说明：离心沉淀集菌法 对试验菌的损伤较大。5、增加了常见干扰物的中和剂或灭活方法 微生物限度检查法.pdf 6、增加了没有方法消除供试品中的抑菌作用 的情况及相关规定 假设没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用，那么验证试验中微生物回收的失败可看成是因供试品的抗菌活性引起的，同时说明该供试品不能被试验菌污染。然而，供试品也可
6、能仅对试验用菌株具有抑制作用，而对其他菌株没有抑制作用。因此，根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规那么，在不影响检验结果判断的前提下，应采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行方法验证试验。假设验证试验符合要求，应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检验。6、增加了没有方法消除供试品中的抑菌作用 的情况及相关规定 计数方法验证时，假设采用上述计数方法总存在一株或多株试验菌的回收率达不到要求，那么选择回收情况最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检测。7、细菌、霉菌及酵母菌计数检查 增加了阳性对照 阳性对照阳性对照 除另有规定外，抗真菌供试品以除另有规定外，抗真菌供试品以白
7、色念珠菌为对照菌，其它供试品以金黄白色念珠菌为对照菌，其它供试品以金黄色葡萄球菌为对照菌，按供试品的细菌色葡萄球菌为对照菌，按供试品的细菌霉菌和酵母菌霉菌和酵母菌计数方法，测定试验菌计数方法，测定试验菌在该供试品中的回收率。回收率应不小于在该供试品中的回收率。回收率应不小于70。否那么实验结果无效，应重新确定。否那么实验结果无效，应重新确定计数方法。计数方法。8、增加了薄膜过滤法每张滤膜增加了薄膜过滤法每张滤膜 冲洗量的规定冲洗量的规定 每张滤膜每次冲洗量不超过100ml，总冲洗量不得超过1000ml 滤膜直径一般为50mm，假设采用其它直径的滤膜，冲洗量应进行相应的调整。9、增加了选择滤膜材
8、质的原那么 选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分枯燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜外表。10、增加了控制菌检查用培养基增加了控制菌检查用培养基 的适用性检查的适用性检查 控制菌检查用的培养基应进行培养基的适用性检查，成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配制的培养基均应检查。检查工程包括培养基的促生长、指示和抑制特性能力。微生物限度检查法.pdf 10、增加了控制菌检查
9、用培养基增加了控制菌检查用培养基 的适用性检查的适用性检查 增菌培养基促生长能力检查：分别接种不增菌培养基促生长能力检查：分别接种不大于大于100cfu的试验菌的试验菌见表见表2于被检培养于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。与定的培养温度及最短培养时间下培养。与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。应生长良好。10、增加了控制菌检查用培养基增加了控制菌检查用培养基 的适用性检查的适用性检查 固体培养基促生长能力检查：取试验菌各固体培养基促生长能力检查：取试验菌各0.1m
10、l50100cfu分别涂布于被检培养分别涂布于被检培养基和对照培养基平板中，每种培养基平行基和对照培养基平板中，每种培养基平行制备制备2个平皿，在相应控制菌检查规定的培个平皿，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养，计数。被养温度及最短培养时间下培养，计数。被检培养基的菌落数与对照培养基菌落数相检培养基的菌落数与对照培养基菌落数相比应不小于比应不小于70%，且生长的菌落形态应一，且生长的菌落形态应一致。致。10、增加了控制菌检查用培养基增加了控制菌检查用培养基 的适用性检查的适用性检查 培养基抑制能力检查：划线接种试验菌培养基抑制能力检查：划线接种试验菌见表见表2于被检培养基平板上
11、，在相应控于被检培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度和时间下培养，制菌检查规定的培养温度和时间下培养，试验菌应不得生长。试验菌应不得生长。10、增加了控制菌检查用培养基增加了控制菌检查用培养基 的适用性检查的适用性检查 培养基指示能力检查：分别接种少量试验培养基指示能力检查：分别接种少量试验菌菌见表见表2于被检培养基和对照培养基平于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度板上，在相应控制菌检查规定的培养温度和时间下培养。被检培和时间下培养。被检培 11、增加了白色念珠菌控制菌检查增加了白色念珠菌控制菌检查 主要针对妇女阴道用药，为保证其平安性而增加。检查法：取供试液
12、10ml相当于供试品1g、1ml、10cm2直接或处理后接种至适量不少于100ml的沙氏葡萄糖肉汤培养基中，培养2448 小时。取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，培养2448小时必要时延长至72小时。11、增加了白色念珠菌控制菌检查增加了白色念珠菌控制菌检查 白色念珠菌在沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的菌落呈乳白色偶见淡黄色，外表光滑有浓酵母气味，培养时间稍久那么菌落增大，颜色变深、质地变硬或有皱摺。假设平板上无菌落生长或生长的菌落与上述菌落形态特征不符，判供试品未检出白色念珠菌。如平板上生长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似，应挑选23个菌落分别接种至念珠菌显色培养基平板上，培养
13、2448小时必要时延长至72小时。假设平板上无绿色或翠绿色的菌落生长，判供试品未检出白色念珠菌。假设平板上生长的菌落为绿色或翠绿色，挑取相符或疑似的菌落接种于1%吐温80玉米琼脂培养基上，培养2448小时。取培养物进行染色，镜检及芽管试验。11、增加了白色念珠菌控制菌检查增加了白色念珠菌控制菌检查 芽管试验芽管试验 挑取挑取1%吐温吐温80玉米琼脂培养基玉米琼脂培养基上的培养物，接种于加有一滴血清的载玻上的培养物，接种于加有一滴血清的载玻片上，盖上盖玻片，置湿润的平皿内，置片上，盖上盖玻片，置湿润的平皿内，置3537、13h，置显微镜下观察，可，置显微镜下观察，可见到由孢子长出短小芽管。见到由
14、孢子长出短小芽管。假设上述疑似菌为非革兰阳性菌，显微镜假设上述疑似菌为非革兰阳性菌，显微镜未见厚膜孢子、假菌丝、芽管，判供试品未见厚膜孢子、假菌丝、芽管，判供试品未检出白色念珠菌。未检出白色念珠菌。二、修订内容二、修订内容 1、修订了控制菌培养温度 控制菌培养温度由3537修订为3035。此项修订不妥，原因：2022版控制菌增加了白色念珠菌，此菌为酵母菌，培养温度为2328。2、删除了控制菌检查验证方法中 阴性菌对照组试验 试验说明：阴性菌对照组实践意义不大 3、修订了菌数报告规那么 细菌、酵母菌宜选取细菌、酵母菌平均菌落数在30300之间小于300cfu、霉菌宜选取平均菌落数在30100之间
15、小于100cfu的稀释级，作为菌数报告取两位有效数字的依据。以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1g、1mL或10cm2供试品中所含的菌数。微生物限度检查法.pdf 4、修订了菌落培养和计数时间培养和计数时间 培养和计数培养和计数 除另有规定外，细菌培养48小时3天，逐日点计菌落数，一般以48小时3天的菌落数报告；霉菌、酵母菌培养72小时5天，逐日点计菌落数，一般以72小时5天的菌落数报告；必要时，可适当延长培养时间至57天进行菌落计数并报告。5、删除了庖肉培养基删除了庖肉培养基 增加：梭菌增菌培养基增加：梭菌增菌培养基 沙氏葡萄糖液体培养基沙氏葡萄糖液体培养基 沙氏葡萄糖琼脂培养基沙氏葡萄
16、糖琼脂培养基 念珠菌显色培养基念珠菌显色培养基(CHROMAGAR)玉米玉米-吐温吐温80琼脂培养基琼脂培养基 6、微生物限度标准修订内容微生物限度标准修订内容 6.1含豆豉、神曲等发酵成分的制剂修订为含豆豉、神曲等发酵成分的制剂修订为含豆豉、神曲等发酵成分的原药材制剂含豆豉、神曲等发酵成分的原药材制剂 6.2菌落数由个修订为菌落数由个修订为cfu，更加科学。，更加科学。Cfu含义含义:colony formine unit,菌落形成单菌落形成单位位菌落数菌落数 例如：细菌数例如：细菌数 每每1g不得过不得过1000个个cfu。每每1ml不得过不得过100个个cfu。6.3阴道、尿道给药制剂阴道、尿道给药制剂 增加了白色念珠菌增加了白色念珠菌检查检查 7 特殊品种可以最小包装单位报告。
