1、香料香精化妆品FLAVOUR FRAGRANCE COSMETICS2023年8月第4期Aug.2023,No.4专论与综述37www.ffc-收稿日期：2022-06-24；修回日期：2022-08-11作 者杭州千岛湖天鑫有限公司，浙江杭州 311700 方婷欢 蒋 晴 唐礼荣 吴凯宾基于 3D 皮肤模型研究植物甾醇酯改善皮肤炎症及屏障的机制摘 要为研究植物甾醇酯（phytosterol ester,PE）抗炎及改善皮肤屏障的作用机制，通过十二烷基硫酸钠（sodium lauryl sulfate,SLS）作用于体外重组三维表皮模型（EpiKutis）构建皮肤损伤模型，检测植物甾醇酯对组织
2、活力、组织形态、炎症因子白介素 1（interleukin-1,IL-1）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）、炎症介质前列腺素2（prostaglandin E2,PGE2）及屏障相关的丝聚蛋白（filaggrin,FLG）的影响。结果表明植物甾醇酯对 SLS 诱导的皮肤损伤模型的组织活力及组织形态无明显作用，对 PGE2、IL-1 表达无显著抑制作用，但当其质量分数高于 1%时能够显著抑制 TNF 表达，并显著促进了 FLG 的表达。因此，植物甾醇酯具备一定抗炎及改善皮肤屏障的功效，但是 PGE2 和 IL-1 不是植物甾醇酯抗炎的靶点。关键词抗炎 皮肤屏障
3、 三维表皮模型 植物甾醇酯Mechanism on Improving Anti-inflammation and Skin Barrier of Phytosterol Ester Based on 3D Skin Model FANG Tinghuan JIANG Qing TANG Lirong WU Kaibin(Hangzhou Qiandaohu Tianxin Co.,Ltd,Hangzhou 311700,Zhejiang,China)Abstract:The aim of the study was to explore the mechanism on improving
4、anti-inflammation and skin barrier of phytosterol ester,based on a EpiKutis 3D skin model which was specially damaged with sodium lauryl sulfate,by detecting the tissue viability,histological morphology,expression of interleukin 1(IL-1),tumor necrosis factor (TNF),inflammatory mediator prostaglandin
5、 E2(PGE2)and filaggrin(FLG).The results showed that phytosterol esters had neither significant positive effects on tissue viability and histological morphology based on SLS-indused skin model,nor inhibitions of PGE2 and IL-1 expresions.However,it showed a significant inhibition of TNF expression and
6、 also a significant promotion of FLG expression,when its mass concentration was higher than 1%.Therefore,phytosterol ester has an anti-inflammatory and skin barrier improvement effects,and PGE2 and IL-1 are not anti-inflammatory targets of phytosterol esters.Keywords:anti-inflammatory skin barrier 3
7、D epidermal model phytosterol ester植物甾醇酯（phytosterol ester,PE），作为一种功能性食品添加剂及天然植物来源的化妆品级油脂，是由植物甾醇（phytosterol,PS）与脂肪酸通过酯化反应得到，主要为 PS 羟基（OH）中的H 被脂肪酸取代成为植物固醇脂肪酸酯 1。PS 是一种天然植物来源的成分，其结构与胆固醇相似，具有调节免疫力、维持内环境稳定、降低胆固醇、细胞抗氧化等作用 2-4。有研究发现 PS 在抗炎性细胞渗出，抑制溃疡方面有显著作用 5。PE 具有较 PS 更优秀的多种重要生理作用如延缓血管衰老专论与综述方婷欢，等作 者 简 介
8、方婷欢（1990），女，硕士，工程师，主要从事功效原料及化妆品功效的研究。联系电话：13757203975E-mail:DOI:10.20099/j.issn.1000-4475.2022.0137专论与综述2023 年 8 月香料香精化妆品38www.ffc-等 6。研究发现 PE 在防止 DNA 氧化损伤和紫外线辐射损伤方面都具有一定的保护作用 7。目前已有近 20 个国家允许 PS 和 PE 在食品中应用，说明PE 具有较高的安全性。基于 PE 对人体具备较多重要的生理功能，且比 PS 具有更优的亲脂性和更佳的降胆固醇效果，PE 在食品、医药、化妆品等领域均得到了广泛应用 8。因 PE
9、拥有与人体皮肤固醇类似的结构和作用，是人体组织细胞的重要成分，并且 PE 可以形成液晶结构，对皮肤具有很高的渗透性，能够起到不错的屏障作用，可以有效地保护皮肤不受外部环境的影响 9，同时增加皮肤弹性、减少皮肤粗糙，可以保持皮肤表面水分、促进新陈代谢，因此认为 PE 是人体保持活力所需的重要物质，是皮肤保持活力必需的补充成分 10。3D 皮肤模型随着功效化妆品产业的发展正广泛地应用于化妆品功效及原料研究领域，通过在体外模拟出人体皮肤组织对受试物质的功效性响应，是化妆品及原料体外功效性评价的有效工具 11。炎症因子白介素 1（interleukin-1,IL-1）是一类促炎症细胞因子，在皮肤炎症反
10、应中起重要作用，表皮角质形成细胞是 IL-1 的主要来源。研究发现 IL-1 的活性也取决于白介素 1（interleukin-1,IL-1），其可在局部水平上作为有效的促炎细胞因子触发血管舒张，并将单核细胞和中性粒细胞吸引到组织损伤和应激部位 12-13。炎症因子肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）是在组织损伤等激活时产生的一类可参与炎症反应调节的细胞毒性蛋白，其含量异常增加能够引起局部炎症反应，表现为水肿、红斑、瘙痒 14。前炎性介质前列腺素 2（prostaglandin E2,PGE2）具有激素样介质的作用，机体在创伤后迅速出现的炎症反应在皮肤上的四大表现
11、症状（红、肿、热、痛）均与 PGE2 密切相关 15。角质层中丝聚蛋白（filaggrin,FLG）是参与皮肤屏障的重要因子，能够促进表皮分化形成表皮角质层独特的屏障结构，在维持皮肤的屏障功能中具有十分重要的作用，而且 FLG 是连接角蛋白纤维的重要分子能够促进角质形成细胞在表皮最外层形成坚实的物理屏障，也能够转化降解形成具有渗透活性的天然保湿因子 16。因此针对 PE 改善皮肤炎症及屏障功能的机制并没有过多具体数据支持。为进一步研究 PE改善皮肤炎症及屏障功效的可能作用机制，通过十二烷基硫酸钠（sodium lauryl sulfate,SLS）17构建 3D 表皮皮肤损伤模型在组织相关水平
12、进行相关标志物含量的定量测试，为其在改善皮肤炎症及屏障相关功效中提供一定试验依据。1 试验部分1.1 主要材料与仪器测试用 3D 皮肤模型（EpiKutis），批号为ES211110，由中国广东博溪生物科技有限公司提供；测试所用植物甾醇酯（phytosterol ester,PE），由中国杭州千岛湖天鑫有限公司研发部提供（总游离甾醇和甾醇酯质量分数 98%）；EpiGrowth培养液，博溪生物；SLS、噻唑蓝（thiazolyl blue,MTT）、地 塞 米 松（dexamethasone,DXMS），美国 Sigma-Aldrich 公司；IL-1 Elisa 试剂盒、TNF Elisa
13、试剂盒、PGE2 Elisa 试剂盒、FLG 抗体，英国 Abcam 公司；二甲基亚砜、多聚甲醛、二甲苯，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；苏木素伊红染色试剂盒，碧云天生物技术有限公司。150i 型 CO2培 养 箱，美 国 Thermo Fisher Scientific 公司；SW-CJ-2FD 型超净化工作台，苏州净化设备有限公司；BX53 型正置显微镜，日本 Olympus 公司；Epoch 型全波长酶标仪，美国BioTek 公司；DM2500 型荧光显微镜，德国 Leica公司。1.2 试验方法1.2.1 样品制备按表 1 所示制备测试样品。1.2.2 皮肤模型培养及分组正常的 3D
14、 皮肤模型转移至提前添加 0.9 mL EpiGrowth 培养液的 6 孔板中，分为空白对照组（Blank 组）、模型对照组（Model 组)、阳性对照组（DXMS 组）、样品测试组（0%、0.5%、1.0%、1.5%PE 组）。Model 组模型表面添加 25 L 质量分数 0.2%的 SLS 溶液构建损伤模型 18。DXMS 组及样品测试组模型表面分别添加 12.5 L 质量分数 0.4%的 SLS 溶液及 12.5 L 质量分数 0.01%的 DXMS和待测试样品，CO2培养箱（37 、体积分数 5%CO2）中孵育 24 h。孵育结束后，无菌 PBS 溶液清洗模型表面残留的受试物，无菌
15、棉签拭去模型内外残留液体，随后进行后续试验。1.2.3 皮肤模型组织活力及组织形态检测按 1.2.2 孵育皮肤模型，模型清洗结束后转移至 24 孔板，每孔加入 0.3 mL 的 MTT 工作液（1 mg/mL），置于培养箱（37 、体积分数 5%第 4 期专论与综述方婷欢，等：基于3D皮肤模型研究植物甾醇酯改善皮肤炎症及屏障的机制39www.ffc-CO2）孵育（3 h5 min）。孵育结束用 PBS 清洗模型外表面且用无菌棉签擦干，转移到新的 24 孔板中。加入 2 mL 异丙醇封口膜密封，孔板振摇器震荡 2 h，200 L 移液器枪头刺穿模型，使异丙醇浸提液从模型内流出，吹打混匀。随后每孔
16、中吸取 2 份 200 L 异丙醇浸提液至 96 孔板，异丙醇作为调零孔，酶标仪 570 nm 波长处读取吸光度（A），按以下公式计算各试验分组的相对组织活力：定 24 h 后，将模型环切取下，进行 FLG 的免疫荧光检测，显微镜下拍照观察，采集图片并分析。1.2.6 结果统计分析应 用 O r i g i n P r o 8 作 图，结 果 表 示 为（MeanSD）。组间统计学差异采用 t 检验或单向方差分析，以P0.05为无显著性差异，P0.05及P0.01分别为有显著性和极显著性差异。2 结果与讨论2.1 PE 对 SLS-3D 皮肤损伤模型组织活力和组织形态的影响如图 1 所示，与
17、Blank 组相比，Model 组的皮肤模型组织活力显著下降，说明本次测试刺激条件有效，皮肤损伤模型构建成功。与 Model 组相比，DXMS 组和样品组的组织活力均显著上升，而与0%PE 组相比，0.5%、1.0%、1.5%PE 组组织活力均无统计学变化，即 PE 对组织活力无作用。HE 染色结果如图 2 所示，与 Blank 组相比，Model 组的皮肤模型角质层疏松增厚，活细胞层受损，活细胞层数减少、有空泡出现，说明 SLS 刺激条件有效。与 Model 组相比，DXMS 组皮肤模型四层结构边界清晰，活细胞层细胞排列较为紧凑，角质层疏松增厚现象明显改善。各样品组对皮肤模型组织形态略有改善
18、作用，与 0%PE 组相比，0.5%、1.0%、1.5%PE 组皮肤模型组织形态改善作用并不明显，即认为 PE 对组织形态无明显表 1 测试样品信息序号原料名称质量分数/%0%PE 组0.5%PE 组1.0%PE 组1.5%PE 组1去离子水82.3381.8381.3380.832甘油6.006.006.006.003辛酸癸酸甘油三酯（GTCC）7.007.007.007.004甘油硬脂酸酯柠檬酸酯1.501.501.501.505鲸蜡硬脂醇0.700.700.700.7061,2-己二醇0.500.500.500.507对羟基苯乙酮0.500.500.500.508棕榈酸0.350.350
19、.350.359甘油硬脂酸酯0.300.300.300.3010生育酚0.500.500.500.5011卡波0.200.200.200.2012精氨酸0.120.120.120.1213PE00.501.001.50组织活力=100%A给药孔 A调零孔A对照孔 A调零孔按上述方法孵育皮肤组织模型，模型清洗结束后用质量分数 4%的多聚甲醛固定 24 h 后，将模型环切取下，进行 HE 染色检测，显微镜下拍照观察，采集图片并分析。1.2.4 皮肤模型炎症因子表达检测按 1.2.2 孵育皮肤组织模型，模型清洗结束后收集皮肤模型培养液于离心管中，随后将用于Elisa 检测的样品置于 80 冰箱冷冻保
20、存，根据 IL-1 Elisa 试剂盒、TNF Elisa 试剂盒、PGE2 Elisa 试剂盒的操作说明书进行检测分析。1.2.5 皮肤模型屏障蛋白表达检测按 1.2.2 孵育皮肤组织模型，模型清洗结束后收集皮肤模型培养液于离心管中，收集完后将用于 FLG 检测的模型用质量分数 4%的多聚甲醛固专论与综述2023 年 8 月香料香精化妆品40www.ffc-图 1 不同质量分数 PE 对表皮皮肤模型组织活力的影响#代表与 Blank 组相比 P 0.01，*代表与 Model 组相比 P 0.01，*代表与 Model 组相比 P 0.05，无其他组间统计学图 3 不同质量分数 PE 对表皮
21、皮肤模型 IL-1 含量的影响#代表与 Blank 组相比 P 0.01，*代表与 Model 组相比 P 0.01，*代表与 Model 组相比 P 0.05，&代表与 0%PE 组相比 P 0.01，&代表 0%PE 组相比 P 0.05图 4 不同质量分数 PE 对表皮皮肤模型 TNF 含量的影响#代表与 Blank 组相比 P 0.01，*代表与 Model 组相比P 0.01，*代表与 Model 组相比 P 0.05，&代表与 0%PE 组相比 P 0.01图 5 不同质量分数 PE 对表皮皮肤模型 PGE2 含量的影响#代表与 Blank 组相比 P 0.01，*代表与 Mode
22、l 组相比 P 0.01图 2 不同质量分数 PE 对表皮皮肤模型组织形态的影响1.5%PE0.5%PEDXMS1.0%PE0%PEModelBlank#*组织活力/%1201008060402001.5%PE0.5%PEDXMS1.0%PE0%PEModelBlank#*&10 9/(g L 1)1401201008060402001.5%PE0.5%PEDXMS1.0%PE0%PEModelBlank#*&*&10 9/(g L 1)87655432101.5%PE0.5%PEDXMS1.0%PE0%PEModelBlank#*10 9/(g L 1)1101009080706050403
23、0Blank0%PE1.5%PEModel0.5%PEDXMS1.0%PE作用。2.2 PE 对 SLS-3D 皮肤损伤模型炎症因子表达的影响由图 3、4、5 所示，与 Blank 组相比，Model组的 IL-1、TNF、PGE2 含量均显著上升。与Model 组相比，DXMS 组的 IL-1、TNF、PGE2含量均显著下降；0%PE 组皮肤模型的 IL-1 含量显著下降，而 TNF 和 PGE2 含量均无显著变化；0.5%、1.0%、1.5%PE 各组的 IL-1 和 PGE2 含量则无显著变化；1.0%和 1.5%PE 组的 TNF 含量则显著下降。与 0%PE 组相比，0.5%、1.0
24、%、1.5%PE 组的 IL-1 含量显著上升，1.0%和 1.5%PE 的TNF 含量显著下降。可以认为 PE 在质量分数高于或等于 1.0%时能够显著抑制 TNF 含量，但是对 PGE2 及 IL-1 无抑制作用，即炎症因子 IL-1和炎性介质 PGE2 不是 PE 抗炎功效的靶 点。2.3 PE 对 SLS-3D 皮肤损伤模型屏障相关蛋白表达的影响由 图 6（a、b）所 示，与 Blank 组 相 比，Model 组皮肤模型的 FLG 表达量显著下降，即皮肤损伤模型造模成功；与 Model 组相比，DXMS组的 FLG 表达量显著上升，0%、0.5%、1.0%、1.5%PE 组的 FLG
25、 表达量显著上升；与 0%PE 组相比，1.0%和 1.5%PE 组 FLG 表达量显著上升，甚至在质量分数 1.0%时，FLG 表达量高于 DXMS 组，即 PE 通过促进 FLG 表达起到改善皮肤屏障功效。3 结论通过观察 PE 对 SLS 刺激的人类 3D 皮肤模型第 4 期专论与综述方婷欢，等：基于3D皮肤模型研究植物甾醇酯改善皮肤炎症及屏障的机制41www.ffc-图 6 不同质量分数 PE 对表皮皮肤模型 FLG 表达的影响#代表 Blank 组相比 P 0.01，*代表与 Model 组相比 P 0.01，&代表与 0%PE 组相比 P 0.01（a）免疫荧光试验数据图（b）FL
26、G 蛋白表达光密度分析1.5%PE0.5%PEDXMS1.0%PE0%PEModelBlank#*&*&相对 FLG 蛋白表达8765543210Blank0%PE1.5%PEModel0.5%PEDXMS1.0%PE组织形态、组织活力、炎症因子及屏障相关蛋白的影响，探讨了 PE 改善皮肤验证及屏障功能的相关机制。研究结果显示，PE 针对组织活力、组织形态无明显改善作用，同时针对 PGE2 和 IL-1无抑制作用（图 1、2、3、5），而当 PE 质量分数 1.0%时能够显著抑制 TNF 含量（图 4），猜测炎症因子 IL-1 和炎性介质 PGE2 不是 PE 抗炎功效靶点。而 PE 质量分数
27、 1.0%时能够显著促进 FLG 表达，尤其在 1.0%时 FLG 表达量高于DXMS 组，即认为 PE 通过促进 FLG 表达起到改善皮肤屏障功效。上述研究结果提示了 PE 在人类3D 皮肤损伤模型上针对抗炎及改善屏障方面的功效及相应机制。参考文献方祁利,路雪纯,肖婧泓,等.植物甾醇酯合成方法的研究进1 展 J.中国食品添加剂,2022,33(1):183-190.唐传核,彭志英.一种新型功能性食品：植物甾醇酯 J.中2 国油脂,2001,26(3):60-63.彭建,陈刘浦,贝亦江,等.植物甾醇的生理功能及在动物生3 产中的应用 J.饲料研究,2021,44(5):152-154.王学敏,
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