1、 申请代码 H1602 受理部门 收件日期 受理编号 解除保护 国家自然科学基金 国家自然科学基金 申 请 书 申 请 书(2 0 1 1 版)(2 0 1 1 版)资助类别：面上项目 亚类说明：附注说明：项目名称：LITAF 的肿瘤抑制作用 申 请 人：罗志军 电话：0791-6360551 依托单位：南昌大学 通讯地址：南昌市八一大道 461 号 邮政编码：330006 单位电话：0791-3969145 电子邮箱： 申报日期：2011年3月12日 国家自然科学基金委员会 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 2 页 版本 1.003.256 基本信息基本信息 yoKWT/OQ 姓名
2、罗志军 性别男 出生 年月 1957 年 9 月 民 族 汉族 学位 博士 职称教授 每年工作时间（月）9 电话 0791-6360551 电子邮箱 传真 国别或地区 美国 个 人 通 讯 地 址 南昌市八一大道 461 号 工作单位 南昌大学/基础医学院 申 请 人 信 息 申 请 人 信 息 主 要 研 究 领 域 信号转导对肿瘤代谢和生长的调节 名称 南昌大学 联系人 彭永供 电子邮箱 依托单位信息 依托单位信息 电话 0791-3969145 网站地址 单 位 名 称 在此录入修改 合作研究单位信息 合作研究单位信息 在此录入修改 项目名称 LITAF的肿瘤抑制作用 资助类别 面上项目
3、 亚 类 说 明 附注说明 申请代码 H1602:肿瘤发生 基地类别 研究期限 2012 年 1 月 2015 年 12 月 研究属性 基础研究 项 目 基 本 信 息项 目 基 本 信 息 申请经费 80.0000 万元 摘 要(限 400 字)：摘 要(限 400 字)：LITAF 为多功能小分子蛋白。最近研究发现它在一些白血病细胞内表达下降并能与一些肿瘤抑制蛋白结合。但其仅限于现象描述，未能对它在肿瘤病变过程中作用进行研究。我们首次报道了 LITAF 介于肿瘤抑制分子 AMPK 和 TNFSF15 之间，即 AMPK 上调 LITAF 表达，后者再刺激 TNFSF15 转录；抑制 AMP
4、K 活性或干扰 LITAF 表达，能加重肿瘤细胞恶性程度；施用 TNFSF15 则产生相反效果。结果提示 LITAF 在这一调节轴中起关键作用。本课题旨在进一步揭示 LITAF 肿瘤抑制功能。拟用永生性癌前期细胞干扰 LITAF 表达，确立其向肿瘤演变时相；且将用酵母双杂技技术，筛选基因文库，寻找 LITAF 功能结合伙伴，为研究其作用机制奠定基础。该项目的完成不仅能揭示 LITAF 在肿瘤发生、发展过程中的作用，还将为肿瘤治疗提供新的靶点，为肿瘤的诊断、进展、预后评估提供新的标志物。因此在概念、理念和设计思维上均具有创新性。关 键 词关 键 词(用分号分开，最多 5 个)LITAF；AMPK
5、；TNFSF15；肿瘤生长；肿瘤抑制基因 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 3 页 版本 1.003.256 项目组主要参与者项目组主要参与者（注:项目组主要参与者不包括项目申请人）编号 姓 名 出生年月 性别职 称 学 位 单位名称 电话 电子邮箱 项目分工 每年工作时间（月）1 宋况余1971-1-25 男 副教授 硕士 南昌大学 0791-3630551 细胞培养、流式检测 8 2 凌云1968-11-26 男 副教授 硕士 南昌大学 0791-6362231 酵母双杂交 8 3 涂硕1981-6-27 女 博士生 硕士 南昌大学 0791-6360551 基因克隆、载体构建 8
6、 4 郑剑1980-9-28 男 博士生 硕士 南昌大学 0791-6360551 酵母双杂交等8 5 王丽丽1987-3-8 女 硕士生 学士 南昌大学 0791-6362231 细胞培养、生化检测 10 6 余克花1963-1-8 女 实验师 其他 南昌大学 0791-6360551 动物实验 8 7 钟斌1986-8-27 男 硕士生 学士 南昌大学 0791-6362231 动物实验 10 8 邹逢琳1986-9-3 女 硕士生 学士 南昌大学 0791-6362231 细胞培养、生化检测 10 9 在此录入修改 总人数 高级 中级 初级 博士后 博士生 硕士生 9 3 1 2 3 说
7、明:高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请人负责填报（含申请人），总人数由各分项自动加和产生。国家自然科学基金申请书 2011 版 第 4 页 版本 1.003.256 经费申请表经费申请表 （金额单位：万元）科目 申请经费 备注（计算依据与说明）一.研究经费 一.研究经费 54.0000 1.科研业务费 8.4000 （1）测试/计算/分析费 2.4000测序、流式细胞仪检测等（2）能源/动力费 2.4000水电费，按 3%收取（3）会议费/差旅费 1.8000参加全国相关学术会议 0.3000/人次6 人次（4）出版物/文献/信息传播费 1.8000论文版面费 0.3000/
8、篇6 篇（5）其他 2.实验材料费 38.0000 （1）原材料/试剂/药品购置费 30.5000购置构建腺病毒载体、基因克隆、酵母双杂交等相关试剂、各种抗体及其他试剂（2）其他 7.5000购置裸鼠及其饲养费 3.仪器设备费 7.6000 （1）购置 7.6000购置一次性消耗品、加样器等（2）试制 4.实验室改装费 5.协作费 二.国际合作与交流费 二.国际合作与交流费 10.0000 1.项目组成员出国合作交流 2.5000参加国际相关学术会议 2.境外专家来华合作交流 7.5000邀请国外专家访问、指导工作等 三.劳务费 三.劳务费 12.0000用于本项目相关的博士/硕士研究生生活补
9、贴 四.管理费 四.管理费 4.0000按 5%收取 合 计 合 计 80.0000 国家其他计划资助经费 其他经费资助（含部门匹配）与本项目相关的 其他经费来源 其他经费来源合计 其他经费来源合计 0.0000 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 5 页 申请者在撰写报告正文时，请遵照以下要求：1、请先选定项目基本信息中的资助类别，再填写报告正文；2、在撰写过程中，不得删除系统已生成的撰写提纲（如误删可点击“查看报告正文撰写提纲”按钮，通过复制/粘贴恢复）；3、请将每部分内容填写在提纲下留出的空白区域处；4、本要求将作为申请书正文撰写是否规范的评判依据，请遵照要求填写。查看报告正文撰写
10、提纲 报告正文 报告正文面上项目申请书撰写提纲 面上项目申请书撰写提纲（一）立项依据与研究内容（一）立项依据与研究内容（4000-8000 字）：1.项目的立项依据1.项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录）前言前言 癌症是由于遗传和环境因素相互作用而引起的疾病，它位于我国五大致死性疾病之首【1】。随着人们对疾病的防患意识的加强和诊断治疗技术的提高，其它危及生命的疾患如心血管疾病、脑血管意外有下降的趋势。但随着工业污染、迈入工业化国家而带来的紧张工作环
11、境以及吸烟等环境因素的影响，癌症的发病率逐年上升。致使癌症发病率和死亡率上升的另一因素是我们对它的发病机制尚未完全掌握，未能针对不同发病机制的癌症进行个体化的治疗。虽然，我们投入了大量的人力物力对肿瘤的发病机制进行研究，并取得了巨大的进展，发现了许多重要的突变基因。由于这些变异，致使一些刺激细胞生长的原癌基因（protooncogene）变为失控的癌基因(oncogene)或抑制细胞生长的所谓肿瘤抑制基因(tumor suppressor)失去活性。但是，肿瘤的发病是一个复杂的过程。近年的研究表明，参与体内细胞生长、代谢正常过程的许多因子都有可能发生变化，直接或间接的参与肿瘤的发病机制。因此，
12、我们的研究思路不应只局限于传统的癌基因和肿瘤抑制基因。基此，我们欲通过国家自然科学基金的资助，探索脂多糖诱导的甲型肿瘤坏死因子转录调控因子（Lipopolyaccharide-induced tumor necrosis factor alpha factor,LITAF）蛋白的肿瘤抑制因子的新功能。该功能迄今尚未深入研究，仅为我们新近的研究所揭示。脂多糖（Lipopolyaccharide，LPS）为革兰氏阴性杆菌细胞外膜的主要成分，由脂质和多糖共价结合的大分子结构，属于内毒素。感染体内后，作用于宿主细胞表面的肿瘤坏死因子类似受体（TLR）【2】刺激细胞产生炎症介质、引起细胞凋亡等炎症反应。
13、LITAF 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 6 页 最早于 1997 年由 Vogelstein 博士实验室克隆并报道为受肿瘤抑制因子 p53 正调控的蛋白，被命名为 p53诱导基因 7（p53-inducible gene 7,P7G）【3】。当时未作功能研究，且有一个碱基插入误差，估计为测序所致。两年后，Amar 博士实验室发现并克隆了同一基因，它编码的蛋白其功能受 LPS 调控，激活后迁移至细胞核内，结合到转录子上特定的序列，刺激甲型肿瘤坏死因子（TNF）等炎症介质的转录，故命名为 LITAF【48】。LITAF 结构结构 LITAF 由 161 氨基酸组成，在十二烷基硫酸钠-
14、聚本稀酰胺电泳（SDS-PAGE）时呈现的分子量约为 26 kDa（图 1）。它具有突特的二级结构，计算机模拟分析显示，只有 8.1%的氨基酸形成-螺旋，7.5为 链，84.5 为环线或与非正规的二级结构。羧基部分在脊椎动物类高度保守，主要含高度保守的类似于泛素连接酶的锌环结构（又称锌带），后者又由两个保守的锌结合基序（zinc finger binding motif）组成。这两个锌结合基序正好被仅占 8.1%的疏水性-螺旋结构所间断。因而，这一锌环不被认为有泛素连接酶活性。事实上，它的泛素连接酶活性也没有得到证实。锌结合基序也可能参与其它生物过程，比如，蛋白质相互作用，DNA/RNA 的结
15、合和脂质结合等。因此，LITAF的锌结合基序之功能有待于进一步研究。LITAF 细胞内定位与功能细胞内定位与功能 有趣的是，LITAF 的氨基酸序列与另一蛋白完全相同，即溶酶体/晚期内吞体小整合膜 蛋 白（Small Integral Membrane Protein of the Lysosome/late Endosome，SIMPLE)【9】，SIMPLE 主要定位于细胞内溶酶体和晚期内吞体膜以及高尔基体膜结构，被认为参与细胞内变形蛋白和膜蛋白的转运，将它们运至Fig 1.LITAF 结构结构 特征性的蛋白质结合位点和功能区域标明如：特征性的蛋白质结合位点和功能区域标明如：PPXY 与含
16、与含 WW 区域的蛋白结合，区域的蛋白结合，羧基部分含两个锌结合位点。部分结合蛋白如图示，说明见正文。羧基部分含两个锌结合位点。部分结合蛋白如图示，说明见正文。Fig 2.LITAF在细胞内的功能定位假设在细胞内的功能定位假设 目前的研究表明LITAF可定位在细胞核内和核外。在核外可能参与蛋白质降解、再生循环周期，在核内参与转录调控。国家自然科学基金申请书 2011 版 第 7 页 溶酶体和晚期内吞体降解消化掉。这一功能的失活被假设为一罕见外周神经脱髓鞘遗传病（Charcot-Marie Tooth disease，type 1C，CMT1C）的病因。事实上，LITAF 基因突变被频繁地发现于
17、 CMT1C【1012】。有一种假设，外周神经髓鞘的雪旺氏细胞（Schwann cells）膜上一种主要膜蛋白 PMP 因 LITAF 的功能失活而不能进入降解循环，致使其堆积在膜上和细胞内，导致雪旺氏细胞凋亡。然而，有关 LITAF 突变基因的功能分析尚未见报道。同时，也未见有它参与蛋白降解的直接证据。这一功能只是根据它与几位参与蛋白泛化、降解的蛋白的结合而推断的。如 LITAF的氨基段能与 NEDD4 和 TSG101 蛋白结合【13】。NEDD4 属于 E3泛化连激酶，TSG101 为肿瘤抑制因子，它们与 LITAF被共定位于高尔基体、溶酶体等位点。此外，LITAF可位于细胞核内，作为转
18、录调控因子，调节基因表达。虽然，在静息状态下，它主要位于核外，但在外界因素的刺激下，它能迁移之核内，调节基因表达（图 2）。LITAF 与肿瘤的关系与肿瘤的关系 如上所述，LITAF最早被发现为肿瘤抑制因子 p53的靶蛋白；有报道显示，LITAF能结合一些肿瘤抑制因子如 WW domain oxidoreductase（WWOX）、tumor susceptibility gene 101(TSG101)、cell death-inducing DFF45-like factor-3(CIDE-3)【1315】，但结合后导致的生物效应尚未见揭示。另外，LITAF 基因被报道在原发性淋巴瘤临床标
19、本中存在纯合子缺失或启动子甲基化【16】。还有一报告表明，LITAF 的表达在急性白血病患者的骨髓样本中显著性减少，但在接受治疗、出现分化型白血病反应时，LITAF 的水平呈上调趋势【17】。这些报道提示，LITAF对肿瘤的发生具有负面影响或逆相关性。数年前，我们首次提出单磷酸腺苷激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）为肿瘤抑制因子（图 3）【1820】。因为，AMPK在细胞内能量缺乏时被激活，过剩时受抑制。激活后，它能抑制细胞内蛋白质、脂肪酸、多糖的合成，这些过程为肿瘤细胞增殖所必需。长时间激活后，AMPK能阻止细胞周期进展，诱导细胞Fig 3.A
20、MPK 的肿瘤抑制因子功能的肿瘤抑制因子功能 注解：FOXO3a,O class of forkhead family of transcription factor;SREBP1,sterol responsive element binding protein 1;ACC,acetyl CoA carboxylase-rate limiting enzyme for fatty acid synthesis,HMGCR,HMG-coA reductase-rate limiting enzyme for sterol synthesis;FASN,fatty acid synthase;T
21、SC2,tuberous sclerosis complex 2;raptor,mTOR adaptor 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 8 页 Fig 4.AMPK-LITAF 肿瘤抑制轴假设肿瘤抑制轴假设AMPK-LITAF 通过其效应靶将肿瘤抑制信号逐次放大自噬、衰老甚至凋亡。这些功能均符合肿瘤抑制因子的特性。事实上，AMPK与许多肿瘤抑制因子和癌基因存在功能上的联系：它是肿瘤抑制因子 LKB1 蛋白激酶的磷酸化底物，其活性受磷酸化激活；激活后的 AMPK 通过其本身蛋白激酶活性，磷酸化调控下游分子的活性，比如它可激活肿瘤抑制因子 p53、P21、P27、FOXO3,和抑制 m
22、TOR，而后者在许多肿瘤内处于激活状态【19,20】。在利用 DNA 芯片技术寻 AMPK 的分子靶时，我们发现了两个有趣的蛋白，LITAF和肿瘤坏死因子大家族成员 15（tumor necrosis factor superfamily member 15,TNFSF15）【21】。进一步 的 研 究 证 明 了 肿 瘤 细 胞 内 存 在AMPK-LTAF-TNFSF15 的线性关系，并且它发生在mRNA 的转录水平，即 AMPK 通过某种机制，调节 LITAF 的转录，使其表达增加；LITAF 再调节TNSF15 的转录表达。当我们用 RNA 干扰技术将LITAF敲除时，肿瘤细胞增殖、贴
23、壁非依赖性生长(anchorage-independent growth)、异种移植肿瘤(Xenograft)均加快。因此，我们的研究首次为 LITAF 对肿瘤细胞的抑制作用提供了直接的证据【22】，导致我们提出了新的假说（图 4），为揭示它的功能开拓了新的方向，前景令人鼓舞。但是，我们必须正视它的局限性，因为我们的上述研究基于已经恶化了的肿瘤细胞，难以为 LITAF在肿瘤发生、发展过程中提供机制性的解释。因此，进一步对这方面进行深入的研究构成了我们本项目的立项依据。酵母双杂交技术酵母双杂交技术 该技术发明于上世纪八十年代末【23】（图 5），原理是将酵母内调节基因表达的转录调控子（如调节半乳
24、糖代谢）的 DNA结合部分和转录激活部分拆成两半，将 DNA 的结合部分（DB）与我们所用的目的分子（又称诱饵，bait）链接在一起，将转录激活部分（AD）与基因文库的 cDNA（又称祈祷分子，prey）链接Fig 5.酵母双杂交技术筛选基因文库示意图酵母双杂交技术筛选基因文库示意图 摘自Clontech(美 国)网 页 http:/ id=206489&tabno=2 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 9 页 在一起。将编码这两种融合蛋白的两种质粒转入酵母内，当诱饵蛋白遇到特异性结合的祈祷蛋白时，它们的相互结合重构转录子的功能，激活报告基因（reporter gene）的转录，从而表
25、达报告蛋白，产生一定的表型。美国的 Clontech生物制剂公司改良了这一技术：将四种报告基因置于该调控下，它们控制四种关键代谢酶的表达，包括抗生素、颜色反应（蓝色）、两种营养素(组氨酸：histidine；腺嘌呤：adenine），亦即蛋白质的相互作用可以使有这些代谢缺陷的宿主酵母在有抗生素、缺乏组氨酸和腺嘌呤的培养条件下生存，并可以通过蓝色菌落来鉴定，而无相互作用的酵母被筛选掉。这一改良大大减少了假阳性的概率，从而加快了筛选的速度。本项目申请人早年用该技术，以 Raf 蛋白激酶为诱饵，成功地克隆了重要信号转导调节蛋白 14-3-3【24,25】。因此，我们将用同一方法，以 LITAF 为诱
26、饵，筛选肿瘤细胞的基因文库，寻找它的结合蛋白，以便进行机制性的研究。并且申请人的合作者，美国波士顿大学的 Amar 博士已用 LITAF在巨噬细胞的基因文库中克隆到其结合蛋白 STAT6（B）【6】。这些先决条件为我们的立项奠定了坚实的依据。参考文献 参考文献 1.He J,Gu D,Wu X,et al.Major causes of death among men and women in China.N Engl J Med 2005;353(11):1124-34.2.Raetz CR,Whitfield C.Lipopolysaccharide endotoxins.Annu Rev
27、 Biochem 2002;71:635-700.3.Polyak K,Xia Y,Zweier JL,Kinzler KW,Vogelstein B.A model for p53-induced apoptosis.Nature 1997;389(6648):300-5.4.Myokai F,Takashiba S,Lebo R,Amar S.A novel lipopolysaccharide-induced transcription factor regulating tumor necrosis factor alpha gene expression:molecular clon
28、ing,sequencing,characterization,and chromosomal assignment.Proc Natl Acad Sci U S A 1999;96(8):4518-23.5.Tang X,Fenton MJ,Amar S.Identification and functional characterization of a novel binding site on TNF-alpha promoter.Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100(7):4096-101.6.Tang X,Marciano DL,Leeman SE,A
29、mar S.LPS induces the interaction of a transcription factor,LPS-induced TNF-alpha factor,and STAT6(B)with effects on multiple cytokines.Proc Natl Acad Sci U S A 2005;102(14):5132-7.国家自然科学基金申请书 2011 版 第 10 页 7.Tang X,Metzger D,Leeman S,Amar S.LPS-induced TNF-alpha factor(LITAF)-deficient mice express
30、 reduced LPS-induced cytokine:Evidence for LITAF-dependent LPS signaling pathways.Proc Natl Acad Sci U S A 2006;103(37):13777-82.8.Tang X,Molina M,Amar S.p53 short peptide(p53pep164)regulates lipopolysaccharide-induced tumor necrosis factor-alpha factor/cytokine expression.Cancer Res 2007;67(3):1308
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32、ting a novel mutation in GJB1 Promoter and a rare polymorphism in LITAF/SIMPLE.Neuromuscul Disord 2006;16(1):14-8.11.Bennett CL,Shirk AJ,Huynh HM,et al.SIMPLE mutation in demyelinating neuropathy and distribution in sciatic nerve.Ann Neurol 2004;55(5):713-20.12.Berger P,Niemann A,Suter U.Schwann cel
33、ls and the pathogenesis of inherited motor and sensory neuropathies(Charcot-Marie-Tooth disease).Glia 2006;54(4):243-57.13.Shirk AJ,Anderson SK,Hashemi SH,Chance PF,Bennett CL.SIMPLE interacts with NEDD4 and TSG101:evidence for a role in lysosomal sorting and implications for Charcot-Marie-Tooth dis
34、ease.J Neurosci Res 2005;82(1):43-50.14.Ludes-Meyers JH,Kil H,Bednarek AK,Drake J,Bedford MT,Aldaz CM.WWOX binds the specific proline-rich ligand PPXY:identification of candidate interacting proteins.Oncogene 2004;23(29):5049-55.15.Min J,Zhang W,Gu Y,et al.CIDE-3 interacts with lipopolysaccharide-in
35、duced tumor necrosis factor,and overexpression increases apoptosis in hepatocellular carcinoma.Med Oncol.2010；DOI:10.1007/212032-9702 Online First.16.Mestre-Escorihuela C,Rubio-Moscardo F,Richter JA,et al.Homozygous deletions localize novel tumor suppressor genes in B-cell lymphomas.Blood 2007;109(1
36、):271-80.17.Wang D,Liu J,Tang K,et al.Expression of pig7 gene in acute leukemia and its potential to modulate the chemosensitivity of leukemic cells.Leuk Res 2009;33(1):28-38.国家自然科学基金申请书 2011 版 第 11 页 18.Xiang X,Saha AK,Wen R,Ruderman NB,Luo Z.AMP-activated protein kinase activators can inhibit the
37、growth of prostate cancer cells by multiple mechanisms.Biochem Biophys Res Commun 2004;321(1):161-7.19.Luo Z,Saha AK,Xiang X,Ruderman NB.AMPK,the metabolic syndrome and cancer.Trends Pharmacol Sci 2005;26(2):69-76.20.Luo Z,Zang M,Guo W.AMPK as a metabolic tumor suppressor:control of metabolism and c
38、ell growth.Future Oncol;6(3):457-70.21.Zhou J,Huang W,Tao R,et al.Inactivation of AMPK alters gene expression and promotes growth of prostate cancer cells.Oncogene 2009;28(18):1993-2002.22.Zhou J,Yang Z,Tsuji T,et al.LITAF and TNFSF15,two downstream targets of AMPK,exert inhibitory effects on tumor
39、growth.Oncogene.2011；PMID:21217782.23.Fields S,Song O.A novel genetic system to detect protein-protein interactions.Nature 1989;340(6230):245-6.24.Luo ZJ,Zhang XF,Rapp U,Avruch J.Identification of the 14.3.3 zeta domains important for self-association and Raf binding.J Biol Chem 1995;270(40):23681-7
40、.25.Tzivion G,Luo Z,Avruch J.A dimeric 14-3-3 protein is an essential cofactor for Raf kinase activity.Nature 1998;394(6688):88-92.国家自然科学基金申请书 2011 版 第 12 页 2.项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题。2.项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题。（此部分为重点阐述内容）2.1 研究内容研究内容 我们将开展两方面的研究：1.在非肿瘤细胞中证实干扰 LITAF促使细胞朝肿瘤方向转化，进一步确认 LITAF的肿瘤抑制因子功
41、能；2.利用酵母菌双杂交的技术寻找 LITAF的功能合作伙伴，以便将来开展机制性的研究。2.1.1 确立确立 LITAF 肿瘤抑制因子功能肿瘤抑制因子功能 2.1.1.1 细胞株的建立 我们将选择如下永生细胞株：非肿瘤发生性前列腺上皮细胞株 RWPE-1 以及肿瘤发生新上皮细胞株如：WPE-NA22、WPE1-NB14、WPE1-NB11与 WPE1-NB26 细胞。这些细胞为 RWPE-1在暴露致癌剂后，转化衍生成新的细胞株，具有不同程度的生长异体移植肿瘤的能力。选用这些细胞的目的有二：一是我们的前期工作来源于前列腺癌细胞株，继续用同组织来源的细胞，使我们的工作有连续性；二是这些细胞具有不同
42、的肿瘤生长能力，便于我们推测 LITAF的失活在肿瘤的发生、发展的时相效应。第二类细胞是永生性的肺泡细胞 BEAS-2B 和由其衍生而成的肿瘤发生性转化细胞BZR和 BBM。上述细胞均可在美国的ATCC公司购得。在细胞培养建立后，我们将制备表达LITAF shRNA的逆转录病毒，将病毒液感染细胞；三天后，用抗生素 Puromycin筛选被病毒整合了的细胞。我们已将该逆转录病毒成功用于感染前列腺癌细胞，并建立了细胞株。2.1.1.2 检测、分析具不同 LITAF 表达水平的细胞功能（1）免疫印迹 将抗生素筛选出来的 LITAF shRNA和对照 shRNA永久细胞株以及原始细胞株制成细胞提取液，
43、一定量的样品用于 SDS-PAGE 电泳，电转运至 PVDF 膜上，用抗 LITAF 抗体孵育、印迹。在确认 LITAF 得到有效敲除后，再检测敲除对其它分子的影响。我们将用同样的印迹方法，检测一些促生成、促凋亡和与 LITAF结合的肿瘤抑制因子，包括：Caspases、Bax、Bcl2、Apaf、CIDE-3、WWOX、TSG101 等。如若在正常状态下，促生成、促凋亡因子没有看到明显变化，我们将用抗肿瘤化学药物如doxorubicin、etoposide、cisplatin 等刺激细胞凋亡，观察它们的变化；如若细胞增殖加快，我们还将检测细胞周期调节因子的表达，如：cyclinD、cycli
44、n B、cyclinA、cycline E、p21、p27 等。国家自然科学基金申请书 2011 版 第 13 页 （2）检测细胞增殖情况 我们将用三种方法检测细胞增殖速度：显微镜检测并计算上述细胞株的倍增时间；MTT 法检测线粒体还原酶活性，比较定量地反映细胞成活状态；检测细胞 DNA的含量和细胞周期状态，美国 Invitrogen生物技术公司发明了一种叫 Click-it EDU 试剂盒具有这两种用途。（3）检测细胞抗凋亡能力 用化学促凋亡剂（doxorubicin、etoposide、cisplatin）刺激细胞，收集细胞，用 FITC-annexin V 和 DAPI 分别标记凋亡的细
45、胞膜和细胞核（DNA），再用流式细胞仪分析区别凋亡的细胞和细胞周期阻滞的阶段。（4）细胞贴壁非依赖性生长的检测 这是检测细胞转化和恶性程度的重要指标。将上述细胞株混以低浓度的琼脂胶（Agar）中，铺在高浓度的琼脂胶床上，加上适当的细胞培养液后，朝着肿瘤转化的细胞可以形成细胞集落，而正常细胞则死亡。（5）异体移植肿瘤的分析 如果在（4）的分析中我们已得出结论，某一细胞株在敲除 LITAF后的细胞贴壁非依赖性生长明显增加，我们将用一定数量的该株细胞，加上对照 shRNA 的细胞，以及相同组织来源的肿瘤发生源性（tumerigenic)细胞，注射入免疫缺乏的裸鼠皮下；在一定时间内观察肿瘤的生长，计算
46、其生长速度。在肿瘤的直径达到 2 厘米时，让裸鼠安乐死亡，取出肿瘤，称重，切成小块速冻，保存于-80以下，以进行组织学和蛋白质分析。（6）结果的统计学分析 凡涉及定量分析的结果，采用平均值标准误（mean SD）相比，同组之间用 student t test 检测，P0.05为显著性界限。2.1.2 酵母双杂交技术寻找酵母双杂交技术寻找 LITAF 结合伙伴结合伙伴 2.1.2.1 组建质粒 用内切酶消化 LITAF和 pGBKT7 DNA-BD 质粒（Clontech，美国），提取纯化 DNA 片段，用连接酶链接后，转染到大肠杆菌菌株。鉴定正确的顺序后，进行可行性测定。2.1.2.2 可行性
47、测试 在将 LITAF诱饵质粒用于筛选基因文库之前，必须确定该质粒单独转入酵母细胞后，不会自行激活转录；与无关蛋白共同表达时，没有非特异性的结合。因此，我们将以下质粒导入酵母菌内：（1）pGBKT7DNA-BD-LITAF；（2）pGBKT7DNA-BD-LITAF x pGADT7-AD(prey,空载体)；（3）pGBKT7DNA-BD-LITAF x pGADT7-AD-Raf 或-14-3-3(阴性对照)；（4）pGBKT7DNA-BD-LITAF x pGADT7-AD-STAT6b(阳性对照，Amar 博士已用酵 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 14 页 母双杂交鉴定其为
48、 LITAF结合蛋白)。当用生长、颜色选择（四种报告表型）时，以上（1）（3）应为阴性，（4）为阳性，即在抗生素(Aeureobasidin A)、无组氨酸、腺嘌呤的培养基上长出菌落，X-Gal 染色呈蓝色。通过该测试，即可用于筛选基因文库。2.1.2.3 筛选基因文库 含有肿瘤细胞的基因文库的酵母菌（Y187）将从 Clontech购得。将 pGBKT7DNA-BD-LITAF 导入酵母菌 YH2Gold，用缺乏色氨酸的选择培养基培养，放大后，于基因文库菌 Y187 混合培养。因这两种菌为阴阳性单倍体，混合后能配对，形成双合体，再将其涂铺在选择培养基上。大约过一至二周，相互作用的菌落能长出来
49、。此时，可将部分菌落作 X-Gal 染色，部分用于放大。放大的部分有两种用途：PCR扩增，进行序列分析；提取质粒，再转入细菌内，作二次假阳性测定。2.1.2.4 甄别假阳性 提取的 prey 质粒用内切酶消化，其插入片段与 LITAF 互换质粒，即将结合蛋白置于诱饵质粒 pGBKT7DNA-BD，将 LITAF 置于祈祷质粒 pGADT7-AD，然后，重新导入酵母菌，如果乃能显示相互作用，该结合得到证实。下一步，是将它们重组到哺乳动物细胞的表达质粒上，与 LITAF 共转入 HEK293T细胞内，用免疫共沉淀和印迹的方法，仅一步证实相互作用。2.1.2.5 功能分析 经过以上的甄别，基本上可以
50、考虑下一步的功能分析。根据经验，我们预测可能得到很大的清单，将要按照其已知功能的重要性来决定先后顺序，例如，根据是否参与肿瘤细胞的生长、存活、凋亡等转化过程，是否是已知或潜在的癌基因、肿瘤抑制基因等。对于未知功能的蛋白（所谓 hypothetic protein），将暂缓一步。作为功能分析的第一步，我们将用免疫沉淀和印迹的方法，检测细胞内源性的目的蛋白是否与内源性的 LITAF相互结合，并用免疫萤光检测它们在细胞内的共定位。此后，将用小分子 RNA干扰技术，沉默它们的表达，以观察是否产生与沉默 LITAF同样的表型。进一步的研究，将超出该基金资助的项目范围，有待申请下一个基金。2.2 研究目标
