1、基本信息 姓名 性别 出生年月 民族 学位 职称 主要研究领域农产品安全与检测技术 电话 电子邮件 传真 个人网页 工作单位 申请者信息 在研项目批准号 名称 代码 联系人 电子邮件 依托单位信息 电话 网站地址 单位名称 代码 合作单位信息 项目名称 优化氰基类拟除虫菊酯农药残留筛查免疫分析方法的基础研究 资助类别 面上项目 亚类说明 自由申请项目 附注说明 申请代码 C02020608:化学保护(抗药性)C0302050204:免疫技术 基地类别 预计研究年限 2008 年1 月 2010 年12 月研究属性 应用基础研究 项目基本信息 申请经费 36.0000 万元 摘要(限400 字)
2、：目前国内外尚无快速可靠筛查拟除虫菊酯类（Pyrethroids，Pys）农药的多残留免疫分析方法，其中最具代表性的氰基类Pys 筛查方法的缺失已成为急需解决的问题，困扰这一问题的关键是方法存在“类特异性”和灵敏度的矛盾。本项目引入分子设计理念，利用纳米粒子具有信号放大作用的特性，提出解决免疫分析方法“类特异性”和灵敏度矛盾的新思路。研究采用量子化学和结构化学的理论和方法，从分子角度设计能最大程度突出和保留氰基类Pys 共性的免疫原分子结构，提高“类特异性”；采用偶联不同蛋白的方法，优选制备全抗原，在此基础上制备和筛选出“宽谱特异性识别”的高亲和力多抗；通过并引入优化的纳米粒子,提高“灵敏度”
3、，研究纳米粒子与抗体的复合及其条件，验证其稳定性。比较纳米粒子-抗体复合物ELISA 与对照ELISA 灵敏度差异。为进一步建立灵敏度高、类特异性好的氰基类Pys 纳米放大ELISA 快速筛查方法提供科学依据。关键词(用分号分开，最多5 个)氰基类拟除虫菊酯；人工抗原分子设计；多克隆抗体制备；纳米粒子-抗体复合物 项目组主要成员（注:项目组主要成员不包括项目申请者，国家杰出青年科学基金类项目不填写此栏。）每年工作时间（月）编号 姓名 出生年月 性别职称 学位 单位名称 电话 电子邮件 项目分工 1 男 研究员 博士 实验设计 3 2 女 助理研究员 博士 免疫原分子设计与合成 6 3 男 研究
4、员 博士 抗体制备与淘选 6 4 男 研究实习员 硕士 抗原识别 6 5 女 研究实习员 硕士 纳米粒子优选 5 6 男 研究实习员 硕士 数据统计、指标检测 6 7 女 研究实习员 硕士 动物实验 5 8 男 博士生 硕士 纳米复合物制备 10 9 女 研究实习员 硕士 免疫原分子设计与合成 8 总人数 高级 中级 初级 博士后 博士生 硕士生 10 3 1 5 1 说明:高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报（含申请者），总人数自动生成。经费申请表（金额单位：万元）科目 申请经费备注（计算依据与说明）一.研究经费 27.6000 1.科研业务费 11.6000 （1
5、）测试/计算/分析费 2.0000 结构测定、分析等（2）能源/动力费 3.6000 水、电、气、燃料消耗费用等（3）会议费/差旅费 3.0000 科学实验、考察、调研、学术交流等所发生的外埠差旅费、市内交通费、会议费用等（4）出版物/文献/信息传播费 3.0000 论文版面费、资料费/复印费、文献检索费、专业通信费、专利申请等（5）其它 2.实验材料费 12.2000 （1）原材料/试剂/药品购置费 12.2000 购买动物、饲养动物、纳米粒子、农药标准样品、试剂等低值易耗品的采购及运输等（2）其它 3.仪器设备费 3.8000 （1）购置 3.8000 购置小型专用仪器设备（2）试制 4.
6、实验室改装费 5.协作费 二.国际合作与交流费 3.0000 1.项目组成员出国合作交流 3.0000 参加国际学术交流 2.境外专家来华合作交流 三.劳务费 3.6000 研究生劳务费 四.管理费 1.8000 按5%计算 合计 36.0000 国家其他计划资助经费 其他经费资助（含部门匹配）与本项目相关的其他经费来源 其他经费来源合计 0.0000 报告正文 报告正文 一、立项依据与研究内容 一、立项依据与研究内容 1.项目的立项依据 1.项目的立项依据 1.1 研究意义 1.1 研究意义 在我国，因农药的长期大量和违规使用，农药残留问题已成为制约农产品安全的首首要因素之一1。目前，解决我
7、国由于对农药残留监控准确性不高和时效性不强造成的科技“瓶颈”问题，已经成为我国经济和社会发展的迫切战略需求。拟除虫菊酯（Pyrethroids）是目前使用最广泛的杀虫剂之一，也是我国农产品中农药残留检出率较高的药种之一。目前拟除虫菊酯类农药已有近50 种工业产品，产量占杀虫剂类产量的20%，使用面积约占整个杀虫剂使用面积的25%2。由于部分拟除虫菊酯类农药残留期较长，对非目标性生物毒性较大，且具有环境内分泌干扰作用，近年来对拟除虫菊酯类农药的关注日益增多3-10。美国已将氰戊菊酯、氯氰菊酯、氯菊酯、苯醚菊酯等拟除虫菊酯类农药列为可疑的环境内分泌干扰物。近年来，许多国家增加了对我国出口茶叶、蔬菜
8、中的拟除虫菊酯类农药的检测力度，拟除虫菊酯类农药的多残留确证检测技术发展日益完善，而急需的快速筛查检测技术却相对落后。拟除虫菊酯类农药的快速筛查检测方法的缺失，已严重制约了我国农产品的安全生产和监管。经查新，目前国内外还没有可推广应用的快速筛查拟除虫菊酯类农药的分析方法。探究原因，方法的特异性和灵敏度之间的矛盾是限制其发展的主要瓶颈。开展快速筛查拟除虫菊酯类农药多残留分析方法基础研究，克服方法的特异性和灵敏度之间的矛盾，具有重要的理论意义和现实意义。1.2 国内外研究现状与分析 1.2 国内外研究现状与分析 农药的快速筛查方法是近年来研究的热点，基于酶抑制的比色法只适合于有机磷农药和氨基甲酸酯
9、类农药，生物传感器法因使用寿命短、稳定性差、线性范围窄而发展缓慢，免疫方法因快速简便、高样品通量而发展迅速。免疫方法是一种以抗体作为生物化学监测器对化合物、酶、蛋白质等物质进行定性和定量的分析方法，是以抗原特异性识别和结合反应为基础的。免疫方法包括放射免疫分析、荧光免疫分析、酶联免疫分析和化学发光免疫分析等。20 世纪80 年代，Hammock 和Mumma 等人1 首先报道了用免疫分析的方法筛选和检测农药残留，这一方法很快受到欧美许多发达国家的高度重视，并因此得到了较大的进展，特别是酶联免疫分析方法（Emzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）除具有快速简
10、便、高样品通量的特点外，还具有费用低、适于现场分析的突出优势，在农业、食品、环境领域的应用基础研究日益深入。目前，对拟除虫菊酯类农药在不同基体中的单残留和多残留的ELISA 方法的研究国内外已有报道，但仅限于氯菊酯、氯氰菊酯、苯醚菊酯、氟氯氰菊酯、高效氟氯氰菊酯、苄呋菊酯、戊菊酯、溴氰菊酯、丙烯菊酯和氰戊菊酯等11 种 5-10、12-20，而且方法的特异性和灵敏度的矛盾表现突出。免疫原分子设计是成功建立农药酶联免疫分析方法关键的第一步。为了制备出效价高、特异性强的抗体，半抗原的分子设计与合成尤为重要。1989 年Stanker L H 10等在拟除虫菊酯类农药的芳香族部位接上一个连接臂，合成
11、了含有苯氧基苄基和环丙烷环的免疫原，该方法适合合成“种特异性”的半抗原；后来发展到以拟除虫菊酯代谢物的衍生物作为半抗原，如2001 年Watanabe 13在拟除虫菊酯类农药的环丙烷部位接上一个连接臂，合成测定类拟除虫菊酯的“类特异性”的半抗原，最近有报道将拟除虫菊酯的氰基水解成羧基或水解后再接上比较长的连接臂与蛋白质偶联，该方法即适合合成“种特异性”的半抗原又适合合成“类特异性”的半抗原。Wengatz 等18从甲氰菊酯的芳香环和丙环端分别引入活性基团，与载体蛋白偶联成免疫原，制备抗体用于ELISA 分析，最低检测限为2.5g/L。1999 年Shan 等19,20在氰戊菊酯分子末端引入氨基
12、或丙酸基分别与载体蛋白合成免疫原制备抗体，最低检测限为3g/L。由于拟除虫菊酯类农药在分子组成上有一定的相似性，研究者可以通过它们的共有结构设计类特异性半抗原，也就是以一类分子的相似部分作半抗原获得特异性抗体。根据拟除虫菊酯类农药的结构特性和空间构型，进行半抗原的设计与合成基础研究，成为解决ELISA 方法特异性的关键问题。抗体制备研究是农药ELISA 方法成功建立的第二个关键点。迄今为止有文献报道的拟除虫菊酯类农药ELISA 方法以多克隆抗体方法为多。1998 年美国加州大学的Lee 等人12得到了对于类拟除虫菊酯的类特异性多克隆抗体，即通用抗体，但是这些类特异性抗体对于类内不同的农药的交叉
13、反应率相差太大；2001 年Watanabe 等人13得到了对于类拟除虫菊酯的类特异性抗体，2005 年Mak 等人14 得到了类拟除虫菊酯的类特异性抗体，也出现了该类特异性抗体对于类内不同的农药的交叉反应率相差太大的问题。虽然多克隆抗体具有检测灵敏度高、“类特异性”的特点，但对于类内不同农药存在交叉反应率相差太大的问题而限制了发展。杂交瘤技术的应用，为小分子化合物单克隆抗体的制备和生产应用创造了条件，单克隆抗体由于来源于单克隆细胞，所分泌的抗体分子在结构上高度均一，甚至在氨基酸序列及空间构型上也均相同，从而具有特异性高的特点。为解决特异性的问题，1992 年Skerritt J H 等人15
14、 制备单克隆抗体建立了对合成菊酯、氯菊酯和1-（R）苯醚菊酯在谷物和面粉中的残留ELISA 检测方法。1998 年Queflelec16 获得了溴氰菊酯的单克隆抗体，这一单克隆抗体对于其他结构相似的拟除虫菊酯类农药的交叉反应率低于1，但灵敏度不高从而不是理想的ELISA检测方法。2001年日本的Nakata 等17利用单克隆抗体技术建立了环境样品和谷物中的氟氰戊菊酯的ELISA 检测法。Nakata 17于2001 年得到氟氰戊菊酯的单克隆抗体，对于其他结构类似的拟除虫菊酯类农药的交叉反应率也均低于1。单克隆技术的引入，在一定程度上解决了ELISA 方法的特异性问题，但由于拟除虫菊酯类农药的抗
15、原决定簇较多，且该类农药大多有手性碳原子，光活性异构体较多，导致单克隆抗体方法检测该类农药虽然特异性有所改进，但灵敏度不高，而且制备过程繁琐、周期长、成本高，产量亦相对有限。这也是直到目前为止没有商品化的单克隆ELISA 试剂盒的主要原因。近年来新发展的重组抗体技术彻底越过了通常意义上的动物免疫过程，避免了传统杂交瘤技术繁难的细胞操作过程，并且扩大了筛选的容量，使原本103 的杂交瘤筛选容量扩增到了106 以上，同时由于抗体库技术可以使轻、重链可变区基因进行随机组合，从而产生出机体内本不存在的轻重链配对，增加了可筛选抗体的多样性，但重组抗体因活性不能保证而且限制了灵敏度提高。综合比较上述三种抗
16、体技术各有优势和不足，多克隆抗体是农药残留免疫分析技术中制备方法最简单、费用最低、最易实际推广的方法，如能克服特异性较差、交叉反应率相差大的缺点，获得符合实际需求的抗体，对于多残留农药检测无疑是最佳的方法。关于拟除虫菊酯类农药免疫检测方法研究在我国刚刚起步，李志茹等6建立了测定环境样品（自来水、井水和污水）中的氟氯氰菊酯的ELISA 检测法；刘廷凤等7-8建立了环境介质中氯菊酯的间接竞争酶联免疫吸附测定方法；孙成等（申请号200410066163）发明了一种氯菊酯多克隆抗体酶联免疫检测方法；刘曙照等（申请号200410065107）发明了一种用于氰戊菊酯快速检测的直接竞争酶联免疫吸附分析技术及
17、试剂盒；骆爱兰等9对氯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯和溴氰菊酯等五种拟除虫菊酯的间接竞争ELISA 检测方法进行了研究，这是我国唯一一篇拟除虫菊酯多残留ELISA 分析方法的研究报告（查新结果）。总体上，我国目前严重缺乏拟除虫菊酯农药单残留和多残留ELISA 检测方法，无法满足对农产品中该类农药进行快速筛选的需要。纳米材料的研究已成为当今国际上的前沿研究课题，其在分析化学领域已有广泛的应用24，在生物材料、分子载体和缓释系统、生物大分子分离等领域也显示了十分诱人的应用前景。纳米粒子是指大小为10-910-7（1100nm）的单晶或多晶微粒，具有高比表面，可作为药物载体或检测试剂载体，起
18、到放大作用，提高检测系统的灵敏度。纳米粒子作为一个固体颗粒，纳米粒子表面可通过各种方式结合大量酶标抗体，由此可结合多量待检的残留分子，起到信号放大的作用。这一技术最突出的特点是在原有免疫技术基础上灵敏度至少提高100 倍。经查新，该技术在临床病原体检测中有突破，在分子免疫分析方面的研究报告有3 篇。湖南大学魏万之等21-22采用一种新的抗体固定技术，将纳米粒子电沉积到羟磷灰石（hydroxyapatite，HAP）表面来研究免疫传感器，从而提高了体系的稳定性。将该体系用于人的铁传递蛋白的测定，与传统方法相比，该方法体系可以实时监测抗体抗原的反应，简化了分析的步骤。由于纳米结构有着均一的化学和物
19、理性能，有着高的比表面，有利于提高敏感分子的吸附能力，这一技术在免疫分析中的应用，将使灵敏度在原有免疫方法基础上有望提高100 倍23。因此，将纳米技术成功引入，对于解决拟除虫菊酯类农药免疫分析灵敏度与特异性的矛盾具有重要的意义。综上所述，基于目前国内外还没有可推广应用的快速筛查氰基类拟除虫菊酯农药的分析方法（见查新报告），本课题以提高氰基类拟除虫菊酯农药免疫分析的特异性和灵敏度为目标，在已有前期工作基础上，利用量子化学与结构化学的理论，重点研究针对氰基类拟除虫菊酯农药分子设计和合成出能最大程度突出和保留其共性结构的免疫原分子（是克服多克隆抗体交叉反应率相差太大难题研究的关键点），并对其结构进
20、行表征，针对半抗原的活性基团特征，通过不同的偶联方法研究合成相应的人工全抗原；通过多克隆抗体制备研究，淘选获得具有“宽谱特异性识别”的选择性好、亲和力强的通用抗体；采用国家纳米中心提供的多种纳米粒子，研究优化对酶标抗体吸附量大、吸附强度高的无机盐纳米粒子，研究纳米粒子与酶标抗体最佳的复合方法与条件；将纳米粒子-抗体复合物应用于ELISA 中，与对照方法比较，验证方法的灵敏性。上述研究为进一步研究免疫信号至少提高100 倍的快速筛查氰基类拟除虫菊酯农药的纳米放大ELISA检测方法提供理论依据和基础。参考文献 1孙宏伟，李玉珍农产品质量和农药残留的检测技术现代仪器2006，12（2）：6-10 2
21、我国农药杀虫剂类型及现状http：/ 3Ji J,Deng C,Zhang H,Wu Y，Zhang XMicrowave-assisted steam distillation for the determination of organochlorine pesticides and pyrethroids in Chinese teasTalanta2007,71（3）：1068-1074 4 Rissato S R,Galhiane M S,Almeida M V,Gerenutti M，Apon B MMultiresidue determination of pesticides
22、in honey samples by gas chromatographymass spectrometry and application in environmental contaminationFood Chemistry2007,101(4)：1719-1726 5Gao HB,Ling Y,Xu T,Zhu WW,Jing HY,Sheng W,Qing X L,Li JDevelopment of an enzyme-linked immunosorbent assay for the pyrethroid insecticide cyhalothrinJ.Agric Food
23、 Chem2006，54：5284-5291 6李志茹拟除虫菊酯类农药通用抗体制备及高效氟氯氰菊酯免疫检测技术研究南京农业大学硕士论文2004 年10 月 7刘廷凤，刘亚子，孙成氯菊酯农药间接酶联免疫吸附测定法的建立环境科学2006，27：347-350 8刘廷凤，刘亚子，孙成氯菊酯农药抗体制备及酶标抗原合成中国环境科学2005，25：615-617 9骆爱兰，余向阳，张存政，祝树德，刘贤进拟除虫菊酯类农药多残留酶免疫分析方法的建立中国农业科学2005，38：308-312 10Stanker L H,Bigbee C,Van Emon JAn immunoassay for Pyrethro
24、ids：detection of Permethrin in mealJ.Agric Food Chem1989，37：834-839 11Hammock B D,Mumma R O,Harvery J,ZPesticide analytical methodology,Seriers No.136,Proceedings of the ACS Symposium,Washiington,DC1980，321 12Lee H J,Shan GImmunoassays for type synthetic pyrethroids.2.Assay specificity and applicati
25、on to water,soil,and grainJ.Agric Food Chem1998，46：535-546 13Watanabe T,Shan G,Stoutamire D W,Gee S J,Hammock B D Development of a class-specific immunoassay for the type I pyrethroid insecticidesAnalytica Chimica Acta2001,444：119-129 14Mak S K,Shan G,Lee H,Watanabe T,Stoutamire D W,Gee S J,Hammock
26、B DDevelopment of a class selective immunoassay for the type II pyrethroid insecticidesAnalytica Chimica Acta2005,534：109-120 15Skerritt J H,Hill A S,Mcadam D PAnalysis of the synthetic pyrethroids,permethrin and 1(R)phenothrin in grain using a monoclonal antibody-based test J.Agric Food Chem 1992，4
27、0：1287-1292 16Queffelec al,Nodet P,Healters JP Hapten synthesis for a monoclonal antibody based ELISA for deltamethrineJ.Agric Food Chem1998，46：1670-1677 17Nakata M，Fukushima A，Ohkawa HA monoclonal antibody-based ELISA for the analysis of the insecticide flucythrinate in environmental and crop sampl
28、esPest Management Sciences2001，57：269-277 18Wengatz I,Stoutamire D W,Gee S JDevelopment of an enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of the pyrethroid insecticide fenpropathrinJ.Agric Food Chem1998，46：2211-2221 19Shan G，Stoutamire D W,Wengatz IDevelopment of an immunoassay for the pyret
29、hriod insecticide esfenvalerateJ.Agric Food Chem1999，47：2145-2155 20Shan G,Leeman R W,Stoutamire D W Enzyme-linked immunosorbent assay for the pyrethroid permethrinJ.Agric Food Chem2000，48：4032-4040 21Hua Wang,Yanli Liu,Yunhui Yang,Ting Deng,Guoli Shen,*and Ruqin Yu A protein A-based orientation-con
30、trolled immobilization strategy for antibodies using nanometer-sized gold particles and plasma-polymerized filmAnalytical Biochemistry2004，324：219-226 22Liu Yang,Wanzhi Wei,Xiaohua Gao,Jianjun Xia,Han TaoA new antibody immobilization strategy based on electrodeposition of nanometer-sized hydroxyapat
31、ite for label-free capacitive immunosensorTalanta2005，68，40-46 23Alvarez M,Calle A,Tamayo J,Lechuga L M,Abad A,Montoya ADevelopment of nanomechanical biosensors for detection of the pesticide DDT Biosensors and Bioelectronics 2003,18：649-653 24刘江疆，林金明.纳米粒子在分析化学领域的应用进展.生命科学仪器.2005，3：3-10 .项目的研究内容、研究目
32、标,以及拟解决的关键问题.项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题 2.1 研究内容：2.1 研究内容：（1）免疫原分子的设计及其表征（1）免疫原分子的设计及其表征 常用含氰基的拟除虫菊酯类农药主要包括：氯氰菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯、苯醚氰菊酯、氟氰菊酯、氟氯氰菊酯、乙氰菊酯、氰戊菊酯、氟胺氰菊酯等。本研究根据氰基类拟除虫菊酯的共性结构设计合成多种半抗原，探究分子设计的基础和规律，并进行结构表征。选择结构特征明显、偶联率合适的全抗原作为免疫原进一步制备抗体研究。(2)多克隆抗体的制备及其淘选研究(2)多克隆抗体的制备及其淘选研究 利用（1）中合成的人工免疫原免疫新西兰大白兔，分别得到氰基
33、类拟除虫菊酯农药具有“宽谱特异性”的多克隆抗体。对所制备的多克隆抗体进行系统的鉴定和筛选，获得对氰基类拟除虫菊酯具备高识别力、高交叉反应率的抗体。（3）纳米粒子优化（3）纳米粒子优化 采用国家纳米中心提供的多种纳米粒子，研究优化对酶标抗体吸附量大、吸附强度高的纳米粒子。（4）纳米粒子-抗体复合物制备研究（4）纳米粒子-抗体复合物制备研究 利用（2）中所制备的抗体，将优化的纳米粒子与酶标抗体复合制备纳米粒子-抗体复合物，研究复合物的稳定性。（5）纳米粒子-抗体复合物ELISA 与对照ELISA 灵敏度差异比较（5）纳米粒子-抗体复合物ELISA 与对照ELISA 灵敏度差异比较 选择上述制得的纳
34、米粒子-抗体，通过ELISA 法，与对照相比，初步验证和比较氰基类拟除虫菊酯化合物的纳米粒子-抗体复合物ELISA 法的“类特异性”和灵敏度。为进一步研究免疫信号至少提高100 倍的快速筛查氰基类拟除虫菊酯农药的纳米放大 ELISA 检测方法提供基础。2.2 研究目标：2.2 研究目标：本研究是以提高氰基类拟除虫菊酯农药快速筛查分析方法的类特异性和灵敏度为总体目标的纳米放大ELISA 检测方法的前期基础研究。（1）通过研究氰基类拟除虫菊酯农药人工抗原设计的基础和规律，分子设计和筛选出适合氰基类拟除虫菊酯农药的半抗原；（2）研究制备和淘选出适合氰基类拟除虫菊酯农药的“类特异性”强、亲和力高的通用
35、结构抗体；（3）通过优化纳米粒子及其纳米粒子-抗体复合物研究，为进一步研究免疫信号至少提高100 倍的氰基类拟除虫菊酯农药纳米放大ELISA 检测方法提供理论依据。2.3 拟解决的关键问题：2.3 拟解决的关键问题：（1）设计和合成出能最大程度突出和保留氰基类拟除虫菊酯农药共性结构的免疫原分子）设计和合成出能最大程度突出和保留氰基类拟除虫菊酯农药共性结构的免疫原分子 因拟除虫菊酯类农药为小分子化合物，本身没有免疫原性，需先将农药小分子与大分子载体蛋白质偶联制备出免疫原。而小分子与载体蛋白偶联反应的位点选择对所得抗体的“类特异性”识别特性起着决定性作用。因此，本研究拟解决的技术难点在于设计合适的
36、反应技术路线，针对氰基类拟除虫菊酯农药的分子设计和合成出能最大程度突出和保留其共性结构的免疫原分子，找出解决方法类特异性差的关键点。（2）纳米粒子优化及其抗体复合物研究（2）纳米粒子优化及其抗体复合物研究 灵敏度问题一直以来是制约拟除虫菊酯类农药ELISA 方法发展的一个重要因素。纳米粒子表面通过物理吸附或化学结合的方法可结合大量酶标抗体，由此可结合大量待检分子，起到信号放大作用。优化纳米粒子，复合纳米粒子-抗体复合物，是实现高灵敏度ELISA 分析方法的有效途径和重要基础。3、拟采取的研究方案及可行性分析 3、拟采取的研究方案及可行性分析 3.1 研究方法：3.1 研究方法：（1）半抗原的分
37、子设计和合成（1）半抗原的分子设计和合成 根据氰基类拟除虫菊酯农药的结构特点，在碳链骨架末端的双键处进行活化和与蛋白连接是最佳方案。可尝试选用合适的氧化剂（如臭氧氧化/金属还原）的方法将双键转化为活性的羧基和醛基，或者在双键末端继续衍生化出带有活性氨基、羧基或羟基的碳链或芳香结构。在拟除虫菊酯分子其它位置（如苯环、氰基等处）进行活化和偶联也可获得对几种类似结构的化合物都具有交叉反应的抗体。本研究拟设计多套合成路线进行优化选择，确定能最大程度突出和保留其共性结构的免疫原分子合成方案，并从理论上推测所得抗体的亲和力。（2）半抗原与载体蛋白的偶联（2）半抗原与载体蛋白的偶联 农药小分子的半抗原只有偶
38、联到载体蛋白上，才能诱导机体产生免疫应答反应。因此，在制备抗体前首先要合成农药载体蛋白结合物免疫原，即合成人工抗原。本研究拟将上述合成的带有活性基团的半抗原与不同的载体蛋白（牛血清蛋白BSA、卵白蛋白OVA 和钥孔嘁血蓝蛋白KLA 等）进行偶联，对比研究，选择结构特征明显、偶联率最佳的全抗原分子进行免疫。（3）人工抗原纯化及识别（3）人工抗原纯化及识别 人工抗原合成后需要纯化，本研究拟采用将反应物转移至透析袋在磷酸盐缓冲溶液中充分透析、浓缩，并用凝胶层析的方法去除未反应的半抗原，冷冻干燥。采用质谱（MS）、核磁共振光谱（NMR）、傅立叶变换红外光谱（FTIR）等多种手段鉴定半抗原的结构。（4）
39、人工抗原偶联比的测定（4）人工抗原偶联比的测定 本研究拟采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）法和考马斯亮蓝法测定人工抗原的偶联比。（5）抗体的制备和纯化（5）抗体的制备和纯化 经检测后的抗原，采用加强免疫法免疫清洁级新西兰大白兔（中国实验动物中心提供），皮内多点注射，在兔体内诱发相应抗体，取兔血清，经亲和层析的方法提取、纯化抗体。（6）纳米粒子优化及其抗体复合物研究（6）纳米粒子优化及其抗体复合物研究 纳米粒子的优化 纳米粒子的优化 选择两类具有适宜粒径和表面结构的钠米无机材料：无机盐（FePO4、CaCO3）和氧化物（Fe2O3、Fe3O4）。采用扫描电镜等手段来
40、表征纳米粒子的结构，证实纳米粒子的多孔隙性及表面附着性，并通过对负载酶标抗体的纳米粒子各种光谱动力学测量和分析来研究粒子结构变化对酶标抗体的吸附量、吸附强度的影响，寻找最佳的纳米粒子。纳米粒子-酶标抗体复合物的制备 纳米粒子-酶标抗体复合物的制备 首先将过氧化物酶与多克隆抗体复合获得酶标抗体后，制备纳米粒子-酶标抗体复 合物，该复合物可以有效提高抗体与抗原的接触率，从而提高检测的灵敏性。通过控制温度、反应时间、离子浓度、偶联剂等，探索纳米粒子与酶标抗体复合的最佳条件。通过光谱动力学研究纳米粒子与酶标抗体的结合程度、结合量、稳定性。（7）氰基类拟除虫菊酯农药多残留纳米放大免疫分析方法初步验证（7
41、）氰基类拟除虫菊酯农药多残留纳米放大免疫分析方法初步验证 采用ELISA 方法，对比研究，初步验证上述纳米粒子-酶标抗体复合物用于氰基类拟除虫菊酯农药分析的“类特异性”和灵敏度。国家自然科学基金申请书 第 14 页 版本 1.006.166 3.2 技术路线：3.2 技术路线：抗原研究抗原研究 纳米粒子优化纳米粒子优化 抗体研究抗体研究“复合物”，验证对比“复合物”，验证对比 免疫新西兰大白兔获得抗体 免疫新西兰大白兔获得抗体 兔皮内多点免疫注射 兔皮内多点免疫注射 3 月后测抗体效价 3 月后测抗体效价 取血清取血清 免疫 4 次（间隔 2 周）免疫 4 次（间隔 2 周）亲和层析提取、纯化
42、亲和层析提取、纯化 抗体抗体 结果分析结果分析 纳米粒子纳米粒子-抗体复合物抗体复合物验证对比实验验证对比实验 氰基类拟除虫菊酯农药 氰基类拟除虫菊酯农药（氯氰菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯、苯醚氰菊酯、氟氰菊酯、氟氯氰菊酯、乙氰菊酯、氰戊菊酯、氟胺氰菊酯）将氰基衍生成羧基将氰基衍生成羧基 在芳香环末端引入氨基或羧基在芳香环末端引入氨基或羧基以间苯氧基苯甲酸作半抗原以间苯氧基苯甲酸作半抗原 抗原的纯化、识别 抗原的纯化、识别 BSA OVA KLH 优化出最佳全抗原 优化出最佳全抗原 不同纳米粒子不同纳米粒子（国家纳米中心提供）（国家纳米中心提供）纳米粒子表征，验证多孔隙性、表面附着性纳米粒子表征，
43、验证多孔隙性、表面附着性优化纳米粒子优化纳米粒子3.3 可行性分析：3.3 可行性分析：技术上：技术上：本项研究共涉及氰基类拟除虫菊酯农药抗原的分子设计和识别、多克隆通用抗体的制备和纳米粒子-抗体复合物研究三个部分。本课题组在前期的研究中，在拟除虫菊酯农药抗原的分子设计上已取得突破性进展，并已经成功制备小分子化合物如溴氰菊酯、多菌灵、绿磺隆、马拉硫磷等的多克隆抗体和青霉素、庆大霉素等的单克隆抗体，并已申报了2 项酶联免疫方法的专利，积累了小分子化合物抗原的分子设计和识别、不同抗体制备方法方面的经验，在纳米粒子应用研究方面，也进行了探索性的研究。本课题将利用已有基础，借鉴和学习先进方法和经验，研
44、究并完成关键核心内容。理论上理论上：量子化学、结构化学和分析化学理论早已成熟，对农药抗原的分子设计和识别在理论上是可行的，多克隆抗体的制备技术无论在理论还是在实验上均已相对完善和成熟，纳米粒子应用技术已在分析化学领域有很好的应用，将其应用于本研究是其应用研究的拓展和深化，其在理论上是可行的，而且课题组在前期的探索性试验研究中也得到了证实。本课题申请人长期从事农药残留检测技术以及食品安全技术研究，有从事该研究的理论基础，掌握国内外该领域的研究动态，为研究顺利完成奠定了坚实的理论基础。实验上实验上：申请者和课题组主要成员长期从事检测技术方面的研究工作，目前已经建立了多种小分子化学物质的免疫检测方法
45、，掌握农药分子修饰和改造研究的实验手段，国家纳米中心有供本研究用的适宜纳米粒子，国家实验动物中心可供清洁级新西兰大白兔，这些为开展拟除虫菊酯类农药的免疫检测方法基础研究奠定了很好的基础。另外，本研究依托单位拥有农产品质量与食物安全博士点，并即将建成中美联合毒理学实验室（2007 年8 月），是国家“十一五”农产品质量安全体系建设重点单位，许多年轻的博士生、硕士生在本实验室工作，这些为本课题的圆满完成提供了智慧和人力基础。总之，本课题具有完备理论依据、实验技术和人力条件，完成本课题的研究内容，达到预期的研究目标是有充分把握的。4、本项目的特色与创新之处 4、本项目的特色与创新之处 本课题将纳米粒
46、子与免疫分析相结合，在农药分析领域具有前瞻性。而利用量子化学与结构化学的理论，设计和合成出能最大程度突出和保留其共性结构的免疫原分子，不仅是多学科理论的交叉和融合，也是对当前抗原设计理论研究的一项重要补充，具有重要学术意义，将推动小分子半抗原合成理论的发展。本项目的创新点具体体现在以下几个方面：（1）氰基类拟除虫菊酯农药半抗原的分子设计与合成体现多学科理论的交叉和融 合。利用量子化学与结构化学的理论，设计和合成出能最大程度突出和保留其共性结构的免疫原分子，解决多克隆抗体“类特异性”差的难题。（2）多克隆通用抗体制备体现研究内容创新。选用经设计的免疫原分子制备的多 克隆抗体，不仅具有通用性，而且
47、具有高亲和性，适合一类拟除虫菊酯农药的同步分析，具有重要的理论意义，也将推动其它具有相似结构小分子农药抗原抗体研究。（3）纳米粒子酶标抗体复合物研究体现研究思路创新。纳米粒子在农药分析领域应用研究在国内外均具有开创性，可解决传统免疫分析灵敏度低的难题。5、年度研究计划及预期研究结果 5、年度研究计划及预期研究结果 年度 工作内容 预期研究结果 2008.01-2008.10 资料收集及技术进一步调研，设计合成氰基类拟除虫菊酯农药的半抗原，筛选结构特征明显、偶联率合适的抗原；2008.11-2009.10 多克隆抗体制备和淘选；2009.11-2010.07 纳米粒子优化，纳米粒子-抗体复合物研
48、究；2010.8-2010.09 对比研究，初步验证纳米粒子-酶标抗体复合物用于ELISA 方法的类特异性和灵敏度；2010.10-2010.12 完善研究方案，补充实验中可能遗漏的信息和数据，完成研究课题。（1）建立设计氰基类拟除虫菊酯农药人工抗原的合成路线，探求规律；（2）制备出针对氰基类拟除虫菊酯农药特异性强、亲和力高的通用抗体，此抗体具有“类特异性”；（3）优化出吸附量大的纳米粒子，制备出稳定性好的纳米粒子-抗体复合物；（4）初步验证纳米粒子-酶标抗体复合物用于氰基类拟除虫菊酯农药ELISA 方法的类特异性好、灵敏度高；（5）在中外期刊上发表研究论文56 篇，其中SCI 收录论文23
49、篇，申请或获得国内外发明专利项；（6）培养硕士、博士研究生24 名。二、研究基础与工作条件 二、研究基础与工作条件 1、工作基础 1、工作基础 涉及到个人资料，略。2、工作条件 2、工作条件 涉及到单位。略。3、申请人简历 3、申请人简历 涉及到个人隐私，略。三、经费申请说明 三、经费申请说明 科目 预算经费（万元）经费预算说明 共计预算经费 36.00 包括：研究经费27.60 万元，国际合作与交流费3.00 万元，劳务费3.60 万元，管理费1.80 万元。1.研究经费 27.60 包括：科研业务费11.60 万元，实验材料费12.20 万元，仪器设备费3.80 万元。(1)科研业务费 1
50、1.60 科研业务费包括测试/计算/分析费、能源/动力费、会议费/差旅费、出版物/文献/信息传播费。测试/计算/分析费 2.00 课题研究过程中需支付给本单位的测试、分析等费用。能源/动力费 3.60 课题研究过程中相关大型仪器设备、专用科学装置等运行发生的可以单独计量的水、电、气、燃料消耗费用等。会议费/差旅费 3.00 课题研究过程中开展科学实验（试验）、科学考察、业务调研、学术交流、组织开展学术研讨等所发生的外埠差旅费、市内交通费、会议费用等，按照国家有关规定执行。出版物/文献/信息传播费 3.00 用于课题相关文章的版面费(预计发表学术论文68篇,每篇论文版面费1000 元左右,约需8
