1、现代食品XIANDAISHIPIN167/分析检测AnalysisandTestingdoi:10.16736/41-1434/ts.2023.13.041一种可同时检测多效唑、三唑酮、三唑醇的胶体金试纸条研制及应用Development and Application of Colloidal Gold Immunoassay Test Strip for Paclobutrazol,Triadimefon and Triadimenol Pesticides 付辉1，张美娟1，王幸幸2，覃冬梅1，王炳志1，杨星星1（1.深圳市易瑞生物技术股份有限公司，广东深圳518101；2.深圳市通量检
2、测科技有限公司，广东深圳518038）FU Hui1,ZHANG Meijuan1,WANG Xingxing2,QIN Dongmei1,WANG Bingzhi1,YANG Xingxing1(1.Shenzhen Bioeasy Biotechnology Co.,Ltd.,Shenzhen518101,China;2.Shenzhen Total-Testing Technology Co.,Ltd.,Shenzhen518038,China)摘要：农药残留一直是我国亟待解决的重点问题。多效唑、三唑酮及三唑醇是三唑类农药，经常用于果蔬中的病害防治，对人体有一定毒性，可通过血液循环进入人
3、体的神经肌肉处，对神经细胞造成严重损害，进而降低人体脏器的免疫力，引发多种慢性疾病。本文自主研发的快检方法具有快速、靶向、灵敏度高等特点，在检测实际样品时均达到食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量（GB 27632021）的检测要求，适用于对大批量果蔬中这 3 种农药的快速筛查。关键词：多效唑；三唑酮；三唑醇；农药Abstract：Pesticide residues have always been a key problem to be solved in China.Paclobutrazol,triadimefon and triadimenol are triazole comp
4、ounds,which are often used for disease control in fruits and vegetables,and have certain toxicity to the human body,can enter the neuromuscular area of the human body through blood circulation,causing serious damage to nerve cells,and then reduce the immune system of human organs,leading to various
5、chronic diseases.The rapid detection method independently developed in this paper has the characteristics of rapidity,targeting and high sensitivity.When detecting actual samples,it meets the detection requirements in GB 27632021,and is suitable for rapid screening of these three pesticides in large
6、 quantities of fruits and vegetables.Keywords：paclobutrazol;triadimefon;triadimenol;pesticides中图分类号：TS272.7基金项目：广东省粤港澳联合创新领域项目（2021A0505080003）；国家重点研发计划项目（2022YFF1101000）。作者简介：付辉（1984），男，本科，高级工程师，研究方向为食品安全快速检测。通信作者：杨星星（1985），男，硕士，高级工程师，研究方向为食品安全快速检测。E-mail：。多效唑（Paclobutrazol，PBZ）是一种可提高作物产量的植物生长调节剂。三
7、唑酮（Triadimefon，TIN）是一种效率高、有毒、残留量低、效果持久的三唑类杀菌剂。三唑醇（Triadimenol，TIL）是具有一现代食品XIANDAISHIPIN168/分析检测Analysis and Testing定毒性杀菌剂，适用于防治麦类黑穗病、白粉病、锈病以及玉米、高粱等的丝黑穗病。目前常用的农药残留检测方法主要有液相色谱、气相色谱、液相色谱-质谱光谱分析和气相色谱-质谱。但这些技术需要昂贵的实验室仪器、训练有素的操作人员和特定的实验室环境。因此，建立一种简单、灵敏且有效的农产品中三唑类农药的检测方法迫在眉睫。1材料与方法1.1材料与设备XYZ3020 三维划膜喷金仪（杭
8、州峰航科技有限公司）、DA-72AUTO 全自动切条机（BIODOT 有限公司）、智能数显恒温磁力搅拌器（郑州长城科工贸有限公司）、冷冻离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司），相关抗原和抗体由深圳市易瑞生物技术股份有限公司自制。1.2实验方法1.2.1制备标记材料称取 100 mL 一级水于圆底烧瓶，置于磁力搅拌水浴锅中（100，700 rmin-1）搅拌加热至约100 1。加入 4 mL 1%氯金酸溶液，加热搅拌直至二次沸腾，迅速将 4.6 mL 1%柠檬酸三钠加入沸腾后的溶液，8 min 后停止反应，搅拌至室温，转入干燥房中于 4 保存备用。1.2.2标记最适 pH 值筛选胶 体 金 pH
9、的 调 节 采 用 K2CO3溶 液 进 行，用 1 gmL-1的 K2CO3溶液将 6 mL 金标溶液的 pH 分别调成 6、7、8 和 9，放置一段时间后添加 100 L 的10%牛血清蛋白溶液，离心后取上清进行吸光度测定来确定最佳 pH 值2。1.2.3最适抗体标记浓度筛选分别配制浓度为 3 gmL-1和 4 gmL-1的 3 种抗体，与 1 mL 制备好的金溶液振荡混匀，加入 10%牛血清蛋白溶液共 100 L 进行封闭，静置 1 min 后，离心 30 min（12 000 rmin-1），弃上清后将沉淀用保存液重悬保存3。1.2.4抗原、二抗最适浓度筛选T线抗原浓度分别设置为1.2
10、 mgmL-1、0.9 mgmL-1、0.6 mgmL-1和 0.3 mgmL-1，C 线二抗浓度始终固定为1.2 mgmL-1，将不同浓度的抗原和二抗进行胶体金试纸条检测，最终确定最佳组合4。1.2.5制备胶体金标记抗体蛋白用 K2CO3溶液将胶体金调节至合适的 pH 值，加入抗体，混匀后室温下静置反应 10 min 标记。加入适量 10%牛血清蛋白溶液对胶体金上未结合抗体的位点进行封闭，混匀 30 s 后室温下静置反应 15 min。封闭后离心 15 min（4，12 000 rmin-1），弃去上清并加入一定体积的金子保护剂与金标复溶液进行重悬，得金标抗体溶液（湿金），并以一定体积分装于
11、酶标微孔中，冷冻干燥后得到金标抗体（干金）。1.2.6制备试纸条胶体金免疫层析试纸条由聚氯乙烯（Polyvinyl Chloride，PVC）底板、样品垫、硝酸纤维膜（Nitroce-llulose Filter Membrane，NC 膜）和吸水垫组成。其中，NC 膜贴在 PVC 底板的中部，用划膜仪将经过抗原稀释液稀释后的包被抗原和二抗喷涂固定在 NC 膜上分别作为 T 线与 C 线，于 37 烘箱中过夜烘干5。样品垫经过样品垫处理液浸泡处理后于 37 过夜烘干，裁切后贴在底板的下端，覆盖 NC 膜 1 2 mm。吸水垫裁切后贴在底板的上端，覆盖 NC 膜 1 2 mm。最后用切条机切成
12、4 mm 宽的试纸条，与干燥剂一起密封装入铝箔袋中，室温干燥保存，备用。1.2.7试纸条实用性检测样品经过前处理后，吸取上层清液直接用试纸条进行样品检测。1.2.8试纸条特异性检测取 9 种 PBZ、TIN 及 TIL 结构类似物烯效唑、已唑醇、戊唑醇、腈菌唑、烯唑醇、双苯三唑醇、氟硅唑、丙环唑和苯醚甲环唑，每个样品测量 3 次，观察是否与金标抗体有反应。2结果与分析2.1试纸条的条件优化2.1.1鉴定标记材料质量本次研发中所自主制备的胶体金溶液呈紫红色，透明且澄清，无沉淀和絮状物，自主研发的金溶液质量好，其颗粒大小均一。2.1.2确定最适 pH 值随着 pH 值的提高，通过图 1 可知，当胶
13、体金溶液的 pH 值为 8 时，阴性的 T/C 比例最高，且阳性的T/C 最低，表明该浓度 K2CO3下阴性的表现得更稳定，故确定 pH=8 为 PBZ、TIN 及 TIL 的最适 pH 值。现代食品XIANDAISHIPIN169/分析检测AnalysisandTesting678901234T/CpH值 阴性 阳性图 1pH 值对胶体金的影响图2.1.3确定最适抗体标记浓度由表1可知，PBZ的抗体标记浓度为3 gmL-1时，浓度在 3 ngmL-1的标准品，T 线显色不明显，所以在3 ngmL-1的标准品浓度下无法检出；当抗体浓度达到 4 gmL-1，标准品浓度为 3 ngmL-1时，T
14、线不显色，则 PBZ 可以检出，所以 PBZ 的最适标记浓度为 4 gmL-1，则 PBZ 可选择最优抗体浓度为 4 gmL-1，3 ngmL-1为其最低检出限，同理可得，TIN 及 TIL的最适抗体浓度标记分别为 3 gmL-1、4 gmL-1，3 ngmL-1 及 6 ngmL-1分别为 TIN 和 TIL 的最低检出限。综上，本实验 PBZ 及 TIL 的最优抗体浓度为 4 gmL-1，TIN 最优抗体浓度为 3 gmL-1。2.1.4抗原、二抗最适浓度筛选随着抗原浓度的增加，标准线显色效果显著变弱；阴性试纸条的 T 线显色信号随着抗原浓度的降低而升高，当抗原浓度为 0.2 mgmL-1
15、时，表现出可接受的显色强度和最高的抑制率。因此，选择 0.2 mgmL-1作为检测线最佳抗原浓度；当纸条 T 线浓度为 0.2 mgmL-1，C 线为 1.2 mgmL-1时，没有假阴出现，灵敏度好，故确定该条件为最适本实验条件。表 13 种抗体浓度试纸条的 T 线、C 线显色统计表标准品浓度/（ngmL-1）PBZ标记浓度TIN标记浓度TIL标记浓度3 gmL-14 gmL-13 gmL-14 gmL-13 gmL-14 gmL-1TCTCTCTCTCTC0+/-+3+/-+-+-+/-+/-+6-+-+-+/-+/-+-+10-+-+-+-+/-+-+注：+为显色；-为不显色；+/-为显色
16、不明显；T 为检测线；C 为控制线。2.2样品前处理优化在陶瓷的匀浆中加入 9 g 样品（芹菜或韭菜）、乙腈 5 mL、硫酸镁 3 g 进行混合。将所得混合溶液加入大离心管中，剧烈摇晃一段时间，离心 5 min（4 200 rmin-1）。取上清液在室温中氮吹至十分干 燥。重悬在盐溶液中，得到芹菜或韭菜样品提取物用于试纸条检测样品溶液。2.3样品检测移取样品液于小型酶标孔中，吹打、静置后全部转移至新的微孔，在加样后开始计时，3 min 反应结束后判读，超过 15 min 为无效判读。对样品进行前处理后检测，样品重复检测 3 次。图 2 为 PBZ、TIN 及TIL 的样品检测结果。由图 2 可
17、知，随着待测样品加标品浓度的提升，T 线由强变弱，且均在 5 ngmL-1浓度，阳性 T 线弱于阴性，达到检出标准，故待测样品加标品浓度分别为 5 ngmL-1、10 ngmL-1、20 ngmL-1均能检出，达到了食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量（GB 27632021）中三唑酮、三唑醇和多效唑在果蔬中的最低检测要求，为以后研发此类农药胶体金产品提供了前瞻性研究。5 ngmL-110 ngmL-1阴性20 ngmL-15 ngmL-110 ngmL-1阴性20 ngmL-15 ngmL-110 ngmL-1阴性20 ngmL-1T 线图 2PBZ（左一）、TIN（中间）及 TIL（右
18、一）的样品 检测结果图2.4特异性检测本研究选取 9 种结构类似物烯效唑、已唑醇、戊唑醇、腈菌唑、烯唑醇、双苯三唑醇、氟硅唑、丙环现代食品XIANDAISHIPIN170/分析检测Analysis and Testing唑和苯醚甲环唑，分别添加 200 ngmL-1标准品进行检测，如图 3 结果显示 T 线均显色且颜色较深，说明这几个药物与抗体没有交叉反应。烯效唑T 线己唑醇戊唑醇腈菌唑烯唑醇双苯三唑醇氟硅唑丙环唑苯醚甲环唑图 3特异性检测图（标准品浓度为 200 ngmL-1）3结论建立了一种用于农产品中 PBZ、TIN 及 TIL 的检测。采用快速、廉价、有效的 QuEChERS 方法对样
19、品进行预处理前处理优化，研发了检测 PBZ、TIN及 TIL 的试纸条，该试纸条成本更低，特异性好，检测后 3 8 min 就能够进行视觉检测，符合食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量（GB 27632021）的相关要求，因此非常适合在大批量的现场快速筛查中推广使用。参考文献1岳绪辉，杜斌，林栋，等.草甘膦胶体金免疫层析试纸条的研制J.食品科技，2021，46（12）：301-307.2 赵丹青，李志，李明，等.基于胶体金标记米曲霉素的免疫层析试纸法快速筛查 SLEJ.中国微生态学杂志，2022，34（5）：595-598.3 李鹏，李峰，马宏伟.胶体金快速定量法测定玉米赤霉烯酮毒素的方法
20、研究 J.食品安全导刊，2021（30）：66-67.4 邓波，朱卫芳，周雨璊，等.胶体金免疫层析法快速检测肉类中恩诺沙星、四环素、头孢氨苄残留的应用验证研究 J.农产品质量与安全，2023（1）：89-93.5 蔡杰，梁宏超，徐日文.胶体金免疫层析法在畜禽产品兽药残留检测中的应用 J.畜牧兽医科技信息，2021（10）：14.药大学，2019.11 邹美娟.红参作为益生元调节在抗生素作用下小鼠肠道菌群的研究 D.保定：河北农业大学，2018.12SUN R，HYONGJUN J，HEE YOUNG K，et al.Korean red ginseng promotes hippocampal
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