1、基金项目:合肥市第三人民医院院级科研项目(编 号:SYKZ202204)作者单位:230022 合肥市第三人民医院感染性疾病科第一作者:秦浩,男,33 岁,硕士研究生,主治医师。主要从事肝病学研究。E-mail:240100323 肝癌乙型肝炎病毒相关肝细胞癌癌组织 ARHGAP18 水平及其基因调控网络分析秦 浩,方春华,张 磊,冉 斌,汪丽萍,罗 凌,李 应,黄育红【摘要】目的 探讨 Rho GTP 酶激活蛋白 18(ARHGAP18)基因在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌(HBV-HCC)组织水平变化及其功能。方法 在基因表达数据库(GEO)中下载数据集以评估 ARHGAP18 水平。应用 UA
2、LCAN 网站研究不同临床和病理特征的 HCC 组织 ARHGAP18 水平差异及其对预后的影响。在 GEO 数据集对 HBV-HCC 多组学队列转录组数据和甲基化阵列数据分析与 ARHGAP18 水平相关的表观遗传模式。结果HBV 感染患者肝组织 ARHGAP18 水平为(5.620.66),显著高于正常肝组织【(5.040.21),P0.05】;HBV-HCC 肿瘤组织 ARHGAP18 水平为(3988.631701.17),显著高于 HBV-HCC 癌旁肝组织【(1976.34531.32),P0.05】;在肝脏边缘组织、距肿瘤 2 3 cm 癌旁肝组织、肿瘤边缘癌旁肝组织、肿瘤外围组
3、织和肿瘤中心组织 ARHGAP18 水平分别为(7.060.61)、(6.830.47)、(6.820.42)、(7.750.56)和(8.380.79),提示越向肿瘤中心组织,ARHGAP18 水平呈异常升高趋势(P0.05);ARHGAP18 高水平的 HCC患者生存期显著缩短(P0.05);转录组数据提示 ARHGAP18 高水平组存在炎症反应、先天性免疫反应、适应性免疫反应和免疫调节等免疫炎症相关通路的激活。结论 ARHGAP18 与 HBV-HCC 发生发展密切相关,其机制值得进一步研究。【关键词】肝细胞癌;Rho GTP 酶激活蛋白 18(ARHGAP18)基因;细胞衰老;转录组;
4、基因表达数据库 DOI:10.3969/j.issn.1672-5069.2023.05.023ARHGAP18 gene levels and its roles in gene regulation network in patients with hepatitis B virus-associatedhepatocellular carcinomaQin Hao,Fang Chunhua,Zhang Lei,et al.Department of Infectious Diseases,Third PeoplesHospital,Hefei 230022,Anhui Province,
5、China【Abstract】Objective The purpose of this study was to investigate the Rho GTPase-activating protein 18(ARHGAP18)gene levels and its roles in gene regulation network in patients with hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma(HBV-HCC).MethodsIn this study,4 datasets downloaded from the
6、 Gene Expression Omnibus(GEO)database was applied toevaluate the changes of ARHGAP18 gene levels.The ARHGAP18 levels in different clinic-pathological characteristics and itscorrelation to the prognosis of patients with HCC was analyzed in UALCAN website.The transcriptomic data and methylation arrayd
7、ata from GEO dataset“HBV-HCC multi-omics cohort”were used to analyze the epigenetic patterns associated with ARHGAP18.Results The ARHGAP18 level in liver tissues from patients with chronic hepatitis B was(5.620.66),significantly higher than(5.040.21),P0.05 in normal control;the ARHGAP18 level in can
8、cerous tissues from patients with HBV-HCC was(3988.631701.17),significantly higher than(1976.34531.32),P0.05 in paranon-cancerous samples;the ARHGAP18levels in liver margin,2 to 3 cm liver tissue from the tumor,peritumor liver tissue,peri-tumor cancerous tissue and the center oftumors were(7.060.61)
9、,(6.830.47),(6.820.42),(7.75 0.56)and(8.38 0.79),suggesting a tendency ofgradually increased ARHGAP18 levels from the so-called normal liver to the center of tumor(P0.05);the high ARHGAP18 levelwas associated with shorter survival in patients with HCC(P0.05);the transcriptomic data analysis found th
10、e aberrant activationof multiple immune and inflammation-related pathways,such as the inflammatory response,innate immune response,regulation ofimmune effector processes,and adaptive immune response in cancerous tissues with increased ARHGAP18 levels.ConclusionThe ARHGAP18 might be involved in the h
11、apatocarcinogenesis,and its mechanism deserves further study.【Key words】Hepatoma;ARHGAP18;Cellular senescence;Transcriptome;Gene Expression Omnibus 肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的原发性肝癌类型。在世界范围内,乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是 HCC 的主要病因。近年来,尽管分子靶向治疗和免疫治疗等新的496实用肝脏病杂志 2023 年 9 月第 26 卷第 5 期 J
12、Prac Hepatol,September.2023.Vol.26 No.5治疗方法不断出现并逐步应用于临床,HCC 患者 5 a总体生存期(overall survival,OS)并不理想1。因此,在分子水平上更好地了解 HBV 相关 HCC(HBV-HCC)的发病机制可以促进新的诊断和治疗方法的开发。细胞衰老是指由多种因素,如 DNA 损伤、原癌基因异常激活等诱发,使增殖细胞发生周期停滞的一种机制。越来越多的研究证据表明,衰老细胞在肿瘤发生发展过程中具有重要的作用。衰老细胞在肿瘤组织内大量累积,分泌多种炎症细胞因子和蛋白酶等,又被称为“衰老相关的分泌表型”(senes-cence-ass
13、ociated secretory phenotype,SASP)2,3。SASP 可以通过维持干细胞特征、创造免疫抑制环境、诱导耐药性产生等方式,促进肿瘤细胞的生长、侵袭和转移4。ARHGAP18 基因是一个细胞衰老相关基因,通过诱导细胞衰老和抗炎表型,调节细胞增殖和凋亡,参与了多种疾病的发生发展过程5-7。目前,关于 ARHGAP18 基因是否参与 HBV-HCC 的发生和进展,尚无相关报道。本研究评估了数据库HBV-HCC 癌组织 ARHGAP18 水平变化,从转录组和甲基化层面探索了 ARHGAP18 水平与 HCC 发生的分子机制,为其作为 HCC 潜在的治疗靶点和预后指标提供证据。
14、1 资料与方法1.1 数 据 集 获 取 从 基 因 表 达 数 据 库(geneexpressionomnibus,GEO)中 获 得GSE55092、GSE62232、GSE77276 和 GSE83148 共 4 个公开数据集。在 GSE83148 数据集,使用基因芯片(AffymetrixHuman Genome U133 Plus 2.0 Array)对 122 例 HBV感染者肝组织(HBsAg 或血清 HBV-DNA 阳性)和 6例正常肝组织进行 RNA 水平分析;GSE62232 数据集使用同样的基因芯片,对 81 例 HCC 患者肿瘤组织和 10 例 正 常 肝 组 织 进
15、行 RNA 水 平 分 析;GSE55092 数据集使用同样的基因芯片研究 HBV-HCC 患者整个肝脏分子异质性。研究者在 11 例HCC 患者获得了 120 份样本,其中 39 份来自肿瘤中心或肿瘤外围,81 份来自癌旁组织;GSE77276 数据集是 HCC 患者的多组学分析数据集,使用高通量测序和基因芯片对 19 例 HCC 患者肿瘤组织、癌旁组织和门静脉血栓进行拷贝数变异、DNA 甲基化、微小RNA 和转录组分析。1.2 差异表达基因分析 以 ARHGAP18 水平中位数作为截断点,将 GSE77509 中 HBV-HCC 患者分为高水平组和低水平组。应用 R 软件进行绘图和统计学分
16、析。应用 Limma 包分析 ARHGAP18 高水平组与低水平组间差异表达的基因8。P1 被认为是鉴定差异基因表达的阈值。1.3 功能富集分析对差异表达基因(DEmRNA)进行注释,应用基因注释和分析数据库(Metascape,ht-tps:/metascape.org/)进行功能富集分析,包括 GO途径分析9。1.4 甲基化分析应用 ChaMP 包对 Illumina 公司Human Methylation 450K 甲基化芯片进行数据分析10。通过 值鉴定每个样品的差异甲基化探针(DMP),P 0.1 被认为是鉴定差异甲基化位点的阈值。1.5 UALCAN 在线分析UALCAN(http
17、:/ualcan.path.uab.edu)系应用癌症基因组图谱(TCGA)转录组数据和来自 31 种癌症类型的临床数据,可对TCGA 基因数据进行深入分析11。应用 UALCAN 分析不同临床和病理学特征的 HCC 组织 ARHGAP18相对水平以及对预后的影响。1.6 GEPIA 在线分析 基因表达谱交互分析网站是一个基于 TCGA 和基因型-组织表达计划(GTEx)数据提供快速且可自定义功能的在线网站12。GEPIA可以提供关键的交互式和可自定义功能,包括差异表达分析、相似基因检测和降维分析。2 结果2.1 HBV-HCC ARHGAP18 水平异常升高为了解ARHGAP18 是否参与了
18、 HBV-HCC 发生发展,我们应用 4 个 GEO 数 据 集 从 不 同 角 度 比 较 了ARHGAP18 的水平变化。在 GSE83148 数据集,发现 HBV 感染者肝组织 ARHGAP18 RNA 水平为(5.620.66),显著高于正常肝组织(5.040.21),P0.05;在 GSE62232 数据集,发现 HBV-HCC 肿瘤组织 ARHGAP18 水平为(77.2050.82),显著高于正 常 肝 组 织(20.00 5.52),P 0.05;在GSE77509 数据集,发现 HBV-HCC 肿瘤组织 ARH-GAP18 水平为(3988.631701.17),显著高于癌旁
19、组织(1976.34531.32),P0.05;进一步比较距离 HBV-HCC 肿瘤中心不同距离组织 ARHGAP18水平变化,发现在肝脏边缘癌旁组织(37 个样本,区域 1)、距肿瘤 2 3 cm 处癌旁组织(19 个样本,区域2)、肿瘤边缘癌旁组织(25 个样本,区域 3)、肿瘤外围区域组织(26 个样本,区域 4)和肿瘤中心区域组织(13 个样本,区域 5)ARHGAP18 水平分别为(7.060.61)、(6.830.47)、(6.820.42)、(7.75596实用肝脏病杂志 2023 年 9 月第 26 卷第 5 期 J Prac Hepatol,September.2023.Vo
20、l.26 No.50.56)和(8.380.79),提示向肿瘤中心靠近时 AR-HGAP18 水平存在异常升高的趋势(P0.05,图 1)。图 1 距离 HBV-HCC 患者肿瘤中心不同位置ARHGAP18 水平变化2.2 不同临床和病理学特征的 HCC 组织 ARHGAP18水平变化 应用 UALCAN 在线分析网站进行 TCGA-HCC 数据分析,结果发现 HCC 组织 ARHGAP18 水平异常升高;不同肿瘤分期、肿瘤分级和 TP53 是否突变的 HCC 组织 ARHGAP18 水平存在显著性差异;HCC 组织 ARHGAP18 高水平者 OS 显著缩短。2.3 全基因组表达谱与 ARH
21、GAP18 水平之间的关联 对 GSE77509 数据集中转录组数据进行差异分析,以 ARHGAP18 水平中位数为截断点将其分为高/低水平组,每组各 9 例,共鉴定出 661 个上调基因和330 个下调基因(P1,图 2A);在上调基因中发现有抑制细胞凋亡基因(如 CAPN6 等)、HBV-HCC 潜在标靶基因(PTN)、代谢异常相关基因(如 GSTP1 等);下调的基因中包括协调增殖停滞和肝细胞分化的重要转录因子(如 CEBPA)、钙粘蛋白家族基因(如 CDH7 和 CDH12);应用 Metascape 在线数据库进行差异基因功能富集分析,进一步探索在 HBV-HCC 发生和进展过程中重
22、要的信号通路。GO 生物学通路分析表明,差异表达的上调基因主要富集于炎症相关途径(如炎症反应、炎症反应的正调控、炎症反应的调节等)、免疫相关途径(激活免疫反应、免疫效应过程的调节、先天性免疫反应、适应性免疫反应等,图 2B);下调基因富集通路相对零散,主要富集于细胞形态发生、离子跨膜转运等通路(图2D)。令人感兴趣的是,在 ARHGAP18 高水平组基因富集结果提示多条炎症和免疫相关途径被异常激活。应用 GEPIA 在线分析网站对 TCGA 中 HCC 数据进行 ARHGAP18 与 CD274(PDL1)水平相关性分析,结果发现 ARHGAP18 与 CD274 水平呈正相关(图 2C)。2
23、.4 与 ARHGAP18 水平相关的全基因组甲基化改变情况 为鉴定 ARHGAP18 高/低水平组甲基化差异基因,对基因启动子区域的全基因组 DNA 甲基化进图 2 HCC 组织 ARHGAP18 水平与全基因组转录组关联A:ARHGAP18 高低水平组差异基因火山图;B:ARH-GAP18 高水平组上调的 20 条 GO 通路;C:TCGA-HCC 组织 ARHGAP18 与 CD274(PDL1)水平相关;D:ARHGAP18高水平组下调的 20 条 GO 通路行了分析。在 405488 个甲基化位点共确定了 2603个差异甲基化位点(|0.1,P0.05)。与 AR-HGAP18 低水
24、平组比,ARHGAP18 高水平组中有1234 个位点显示出高甲基化,而 1369 个位点显示为低甲基化;高甲基化基因富集于细胞形态发生和细胞周期的正调控等通路,而低甲基化基因富集于腺苷酸环化酶调节的 G 蛋白偶联受体信号通路和 Wnt信号通路的调控等通路;对转录组与甲基化数据联合分析发现,有 28 个基因高表达/启动子低甲基化,4 个基因低表达/启动子高甲基化,高表达/启动子低甲基化基因包括免疫和炎症相关因子 TGFBI 和CD40 等。3 讨论细胞衰老在肿瘤发生过程中起到至关重要的作用13。细胞衰老通过诱导细胞周期停滞和激活免疫监视可以在早期抑制肿瘤发生。然而,衰老细胞可以通过维持干细胞特
25、征、创造免疫抑制环境、诱导耐药性和刺激上皮间质转化等,间接促进肿瘤细胞的生长、侵袭和转移,给临床早期诊断提出了很大的挑战14,15。ARHGAP18 是近年来发现的与细胞衰老相关的基因。ARHGAP18 也被称为 SENEX,是 RhoGAP 蛋白家族成员。该蛋白家族在调节小 Rho GTP 酶活性方面起作用。ARHGAP18 对不同的 Rho GTP 酶表现出不同的特异性。在内皮细胞,ARHGAP18 优先作用于 RhoC16,而在癌细胞,它主要对 RhoA 表现出特异性17。通过抑制 RHoA 信号,ARHGAP18 可以在三阴性乳腺癌和肝细胞癌细胞促进肿瘤细胞转移18,19,并间接调控
26、MAPK 信号通路。本研究表明,ARHGAP18 在多个 HBV-HCC 的GEO 数据集中水平异常升高,与疾病进展密切相关,696实用肝脏病杂志 2023 年 9 月第 26 卷第 5 期 J Prac Hepatol,September.2023.Vol.26 No.5并可能预测了不良的临床结局。为了进一步探索ARHGAP18 基因在 HBV-HCC 发生发展过程中的生物学作用,我们从转录组学等多个层面进行了探索性分析。对 GEO 中 GSE77509 数据集转录组数据分析发现,在差异上调的基因中发现免疫反应、先天性免疫反应、炎症反应等多条重要的免疫和炎症相关通路显著上调,并发现 ARHG
27、AP18 与 PDL1 水平呈正相关,提示 ARHGAP18 可能与肿瘤微环境中免疫抑制作用相关。DNA 甲基化异常改变是癌症的一个特征性的表现。多项研究报道了 HBV-HCC 组织异常的 DNA甲基化20。我们使用 ChAMP 包对 ARHGAP18 高/低水平组进行甲基化位点差异分析,进一步将全基因组转录组数据与甲基化数据进行综合分析,结果共有 32 个基因在 ARHGAP18 高水平组和低水平组之间表现出明显的表观遗传和表达模式改变,并且发现高表达/启动子低甲基化基因包括 TGFBI 和CD40 等免疫和炎症明星因子,提示在 ARHGAP18高水平组存在免疫和炎症相关通路的异常激活。【参
28、考文献】1中国肝炎防治基金会肝细胞癌筛查和监测项目专家组.慢性乙型肝炎病毒感染者肝细胞癌筛查和监测.实用肝脏病杂志,2021,24(6),776-785.2Schmitt C A,Wang B,Demaria M.Senescence and cancer-role andtherapeutic opportunities.Nat Rev Clin Oncol,2022,19(10),619-636.3Sikora E,Bielak-Zmijewska A,Mosieniak G.A common signatureof cellular senescence;does it exist?Ag
29、eing Res Rev,2021,71,101458.4Chambers C R,Ritchie S,Pereira B A,et al.Overcoming the senes-cence-associated secretory phenotype(SASP):a complex mecha-nism of resistance in the treatment of cancer.Mol Oncol,2021,15(12),3242-3255.5Coleman P R,Hahn C N,Grimshaw M,et al.Stress-induced pre-mature senesce
30、nce mediated by a novel gene,SENEX,results in ananti-inflammatory phenotype in endothelial cells.Blood,2010,116(19),4016-4024.6Liang L,Gu W,Li M,et al.The long noncoding RNA HOTAIRM1controlled by AML1 enhances glucocorticoid resistance by activatingRHOA/ROCK1 pathway through suppressing ARHGAP18.Cel
31、lDeath Dis,2021,12(7),1-14.7Wang J,Wang Z,Wang H,et al.Stress-induced premature senes-cence promotes proliferation by activating the SENEX and p16(INK4a)/retinoblastoma(Rb)pathway in diffuse large B-celllymphoma.Turk J Haematol,2019,36(4),247-254.8Ritchie M E,Phipson B,Wu D,et al.Limma powers differ
32、ential ex-pression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.Nu-cleic Acids Res,2015,43(7),e47.9Zhou Y,Zhou B,Pache L,et al.Metascape provides a biologist-ori-ented resource for the analysis of systems-level datasets.Nat Com-mun,2019,10(1),1523.10 Tian Y,Morris T J,Webster A P,et al.ChAMP:u
33、pdated methyla-tion analysis pipeline for Illumina BeadChips.Bioinformatics,2017,33(24),3982-3984.11 Chandrashekar D S,Karthikeyan S K,Korla P K,et al.UALCAN:An updatetotheintegratedcancerdataanalysisplatform.Neoplasia,2022,25,18-27.12 Tang Z,Li C,Kang B,et al.GEPIA:a web server for cancer andnormal
34、 gene expression profiling and interactive analyses.NucleicAcids Res,2017,45(W1),W98-W102.13 Wang SH,Yeh SH,Chen PJ.Unique Features of hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma in pathogenesis and clinical signifi-cance.Cancers,2021,13(10),2454.14 Bottazzi B,Riboli E,Mantovani A.Aging,infla
35、mmation and cancer.Semin Immunol,2018,40,74-82.15 Giannakoulis V G,Dubovan P,Papoutsi E,et al.Senescence inHBV-,HCV-and NAFLD-mediated hepatocellular carcinoma andsenotherapeutics:Currentevidenceandfutureperspective.Cancers,2021,13(18),4732.16 Chang G H K,Lay A J,Ting K K,et al.ARHGAP18:an endoge-no
36、us inhibitor of angiogenesis,limiting tip formation and stabilizingjunctions.Small GTPases,2014,5(3),1-15.17 Maeda M,Hasegawa H,Hyodo T,et al.ARHGAP18,a GTPase-ac-tivating protein for RhoA,controls cell shape,spreading,andmotility.Mol Biol Cell,2011,22(20),3840-3852.18 Chen J,Huang X,Wang W,et al.Ln
37、cRNA CDKN2BAS predictspoor prognosis inpatients withhepatocellular carcinoma andpromotes metastasis via the miR-153-5p/ARHGAP18 signaling ax-is.Aging(Albany NY),2018,10(11),3371.19 Humphries B,Wang Z,Li Y,et al.ARHGAP18 downregulation bymiR-200b suppresses metastasis of triple-negative breast cancer
38、 byenhancing activation of RhoAARHGAP18 downregulation suppressesTNBC metastasis.Cancer Res,2017,77(15),4051-4064.20 Zhang D,Guo S,Schrodi S J.Mechanisms of DNA methylation invirus-host interaction in hepatitis B infection:Pathogenesis and on-cogenetic properties.Int J Mol Sci,2021,22(18),9858.(收稿:2022-11-10)(本文编辑:陈宗炳)796实用肝脏病杂志 2023 年 9 月第 26 卷第 5 期 J Prac Hepatol,September.2023.Vol.26 No.5
