1、流式细胞仪原理流式细胞仪原理 流式细胞术原理流式细胞术原理 流式细胞仪根本结构流式细胞仪根本结构 流式细胞仪的配套设施流式细胞仪的配套设施 流式细胞术的根本概念流式细胞术的根本概念 流式细胞术Flow Cytometry,简称FCM是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒通常是细胞的多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等 研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量 流式细胞仪的特点流式细胞仪的特点 单个细胞分析 同时多参数分析 速度快：10000个细胞/秒 统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况 分选感兴趣的细胞 流
2、式细胞仪的检测范围流式细胞仪的检测范围 细胞结构细胞结构 细胞大小细胞大小 细胞粒度细胞粒度 细胞外表面积细胞外表面积 核浆比例核浆比例 DNA含量与细胞周含量与细胞周期期 RNA含量含量 蛋白质含量蛋白质含量 细胞功能细胞功能 细胞外表细胞外表/胞浆胞浆/核核的特异性抗原的特异性抗原 细胞活性细胞活性 细胞内细胞因子细胞内细胞因子 酶活性酶活性 激素结合位点激素结合位点 细胞受体细胞受体 散射光信号散射光信号 前向角散射光前向角散射光FSC FALS Sensor Laser 散射光信号散射光信号 侧向角散射光侧向角散射光SSC FALS Sensor 90LS Sensor Laser 外
3、周全血细胞散射光双参数点图外周全血细胞散射光双参数点图 红细胞溶解后红细胞溶解后 荧光信号荧光信号 荧光素吸收激光能量 荧光素将吸收能量释放，转换为 振动能和热能 释放较入射光波长更长的光量子 荧光素与特异抗体结合 荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强 荧光信号荧光信号 FreqFluorescence FALS Sensor Fluorescence detector(PMT3,PMT4 etc.)荧光信号荧光信号 激发光源与荧光标记物激发光源与荧光标记物 流式细胞术样本来源流式细胞术样本来源 细胞悬液：别离PBMC、PRP等：操作复杂，别离、离心步骤导致细胞特定群体丧失，并可能引
4、入某些误差 直接使用外周血、骨髓：最接近生理状况，操作简便，样本用血量小 灌洗液、体腔积液 培养细胞、细胞系 实体组织：Medimachine 病理组织：新鲜样本/石蜡包埋样本 针吸组织：新鲜样本 鞘液、洗液、PMA等：清洁无颗粒杂质 单细胞悬液的处理单细胞悬液的处理 荧光标记抗体的染色：使用特异的单克隆抗体 单色分析：直接标记、间接标记 双色分析：SimulSET IMK、HLA-B27 多色分析：TriTEST、MultiTEST、ProCOUNT 溶血：FACS Lysing Solution 细胞打孔：FACS Perm2 固定：1%多聚甲醛 荧光染色荧光染色 染色要求：特异识别某一群
5、细胞，有效区分不同细胞亚群 非特异反响水平低 抗体校价高，用量适用于常规标本 使用特异的单克隆抗体 最好使用荧光直接标记的抗体 采用适当的阴性对照物 抗体最适滴度 Propidium IodidePI 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm PI DNA Excitation Emisson 300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm Fluorescein(FITC)400 nm 500 nm 600 nm 700 nm Wavel engt h Protein Excitation Emisson 300 nm 400 nm 500 nm 600
6、nm 700 nm Excitation Emisson 300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm Phycoerytherin(PE)Protein Allophycocyanin(APC)Protein 632.5 nm(HeNe)Excitation Emisson 300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm 流式细胞仪的组成流式细胞仪的组成 仪器硬件组成仪器硬件组成 计算机硬件系统计算机硬件系统 软件系统软件系统 应用应用 大型机大型机FACSVantage SE 多激光多波长多激光多波长 八荧光参数八荧光参数 高速分选高速分选 单
7、细胞点对点分选单细胞点对点分选 台式机台式机FACSCalibur 双激光双激光 488nm 635nm 四荧光参数四荧光参数 分选细胞富集系统分选细胞富集系统 双激光立体空间激发系统双激光立体空间激发系统 双激光，两点激发，实现4色荧光分析 最大程度地减少荧光信号之间的补偿，提高检测灵敏度 双激光的应用大大扩展了染料的选择范围，亦相应地扩大了仪器的应用领域 DDM(Doublet Discrimination Module)双粘体区分双粘体区分DNA分析的解决之道分析的解决之道 通过信号脉冲FL2-W和FL2-A分析区别实体组织标本中的粘连细胞，最大程度减少假阳性 DDM检查检查区分双粘体细
8、胞区分双粘体细胞 流式细胞仪仪器结构流式细胞仪仪器结构 液流系统液流系统 光学系统光学系统 激光光源 光收集系统 电子系统电子系统 光电转换 数据处理系统 细胞分选系统细胞分选系统 FACSCalibur流式细胞仪液流系统流式细胞仪液流系统 流式细胞仪的光学系统流式细胞仪的光学系统 激光(Laser)是一种相干光源，它能提供单一波长、单一方向、同步的稳定光照 激光波长:488nm,635nm 光收集系统是由假设干组透镜,滤波片,小孔组成，将产生的光信号引导至检测器 流式细胞仪使用的滤光片流式细胞仪使用的滤光片 460 500 540 460 500 540 460 500 540 SP 500
9、 LP 500 BP500/50 Longpass Shortpass Bandpass FACSCalibur 流式细胞仪的光学系统流式细胞仪的光学系统 流式细胞仪的电子系统流式细胞仪的电子系统 进行信号检测和分析进行信号检测和分析 当细胞携带荧光素标记物,通过激光照射区时,受到激发,产生不同波长的、代表细胞内不同物质的荧光信号 荧光信号由光电接收器接收，转变为电信号，可分析电压脉冲的高度、面积和宽度 电脉冲信号经A/D转换成数字信号 数字信号传送到计算机，进行储存、作图、统计分析 流式细胞仪的电子系统流式细胞仪的电子系统 荧光信号的面积和宽荧光信号的面积和宽度信号度信号:面积信号面积信号：
10、对检测到的荧光光通量进行积分得到的测量值，用于细胞DNA含量、RNA含量的测量 宽度信号宽度信号：荧光光脉冲信号的时间 强大的数据处理系统强大的数据处理系统 Macintoshi系统，灵活多样的图形处理能力 强大的软件支持，灵活方便的数据处理功能 仪器自动校检软件FACSComp 主软件CELLQuest 全面的自动化临床应用软件：淋巴细胞自动检测软件SimulSET；MultiSET 干细胞自动检测软件ProCOUNT HLA-B27；ModFIT；QuantiBRITE 流式细胞仪数据分析流式细胞仪数据分析 直方图分析直方图分析 流式细胞仪数据分析流式细胞仪数据分析 点图分析点图分析 流式
11、细胞仪数据分析流式细胞仪数据分析 等高图和密度图分析等高图和密度图分析 流式细胞仪数据分析流式细胞仪数据分析 三维图分析三维图分析 流式细胞仪应用软件流式细胞仪应用软件 主软件：主软件：CELLQuest：样本获取，数据分析：样本获取，数据分析 仪器校正软件：仪器校正软件：FACSComp：仪器自动校准，设定实验分析：仪器自动校准，设定实验分析条件条件 临床应用自动软件：临床应用自动软件：SimulSET/MultiSET：淋巴细胞亚群计数：淋巴细胞亚群计数分析，可报告分析，可报告T淋巴细胞淋巴细胞T辅助细胞、辅助细胞、T抑制细抑制细胞胞、B淋巴细胞、淋巴细胞、NK淋巴细胞含量，还可以淋巴细胞
12、含量，还可以报告绝对计数报告绝对计数 ProCOUNT：干细胞计数分析，报告：干细胞计数分析，报告CD34+细胞绝对值细胞绝对值HLA-B27：自动测定全血：自动测定全血HLA-B27 Retic-COUNT：网织红细胞计数：网织红细胞计数 流式细胞仪应用软件流式细胞仪应用软件 临床应用自动软件：临床应用自动软件：ModFit：DNA周期分析，检查细胞倍体性周期分析，检查细胞倍体性和调亡和调亡 QuantiCALC：荧光定量分析，报告每个：荧光定量分析，报告每个细胞抗体结合量细胞抗体结合量ABC。主要检测白细胞外。主要检测白细胞外表分化抗原和细胞活化指标，用于感染、炎症表分化抗原和细胞活化指标
13、，用于感染、炎症反响和肿瘤治疗的监测反响和肿瘤治疗的监测 其它分析软件：其它分析软件：PAINT-A-GATE：用于多参数资料的分析，：用于多参数资料的分析，同时分辨并显示多个细胞群体同时分辨并显示多个细胞群体 Attractor：用于多参数资料的快速批量分：用于多参数资料的快速批量分析析 流式细胞仪的临床应用流式细胞仪的临床应用 HIV免疫分型，CD4绝对计数 白血病和淋巴瘤的免疫分型 肿瘤的细胞周期和倍体分析 网织红细胞计数 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测 干细胞计数 残量白血病细胞检查 HLA-B27检查 血小板功能及相关疾病 流式细胞仪的科研应用流式细胞仪的科研应用 免疫功能研究 造血干细胞 癌症病人的多药耐药性 细胞动力学功能研究 血小板分析心血管疾病 环境微生物分析 流式细胞术与分子生物学研究
