1、PCRPCR和和DNADNA测序技术测序技术 Polymerase Chain Reaction(PCR，多聚酶链式反响，多聚酶链式反响)特异片断的体外扩增技术特异片断的体外扩增技术 无细胞克隆技术无细胞克隆技术(“free bacteria cloning technique 常用常用PCRPCR仪仪 1993年至今：年至今：计算机技术使循环操作实现了程序化和自动化，简化了计算机技术使循环操作实现了程序化和自动化，简化了PCR操作程操作程序，使之迅速得到推广。序，使之迅速得到推广。PCR技术是方法学上的一次革命，生物学及医学领域的技术是方法学上的一次革命，生物学及医学领域的 一个里程碑，一个
2、里程碑，巨大的推动作用。巨大的推动作用。开展历程开展历程 1983年，由年，由Cetus 公司的公司的Kary Mullis 建立建立 :/karymullis /:/v.youku /v_show/id_XMTU2NDg1MDQ0.html 1985年，年，Saiki等在等在?science?上详细描述上详细描述人珠蛋白人珠蛋白DNA 1988年年 耐热的耐热的Taq DNA聚合酶被发现和应用，把聚合酶被发现和应用，把 PCR推向了实用推向了实用 阶阶段，成为段，成为PCR开展史上又一里程碑开展史上又一里程碑 1989年，美国专利局授予年，美国专利局授予PCR技术专利；技术专利；PCR技术被
3、技术被?science?杂志评选为伟大的技术创造；杂志评选为伟大的技术创造；1989年为年为DNA聚合酶的分聚合酶的分 :/karymullis /子年子年 1993年，年，Mullis 获得诺贝尔化学奖获得诺贝尔化学奖。类似类似DNADNA在细胞内的复制过程在细胞内的复制过程:由一对引物介导由一对引物介导,通过温度调节，使双链通过温度调节，使双链DNADNA变成单链变成单链变性变性；单链单链DNADNA能与引物复性能与引物复性退火退火成为成为 引物引物-DNADNA单链复合物；单链复合物；在在dNTPsdNTPs存在下，存在下，DNADNA聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链聚合酶能使引物沿
4、单链模板延伸成为双链DNADNA延伸延伸 PCRPCR循环：一个热变性循环：一个热变性-复性复性-延伸的过程。延伸的过程。通常，通常，2020-3030个循环之后，可获得大约个循环之后，可获得大约106106倍待扩增的倍待扩增的DNADNA片段的片段的拷贝。拷贝。什么是什么是PCR PCR DNA在细胞内的复制过程a DNA在细胞内的复制过程b DNADNA复制过程中复制过程中,2,2条新生链都只能从条新生链都只能从5 5端向端向3 3端延伸端延伸,前导链连续合成前导链连续合成,滞后链分段合成滞后链分段合成.DNA在细胞内的复制过程c DNA在细胞内的复制过程d DNA在细胞内的复制过程e 1
5、.PCR1.PCR的根本原理的根本原理 在离心管中进行的在离心管中进行的DNADNA合成扩增技术，合成扩增技术，模拟染色体的体内复制过程；模拟染色体的体内复制过程；与体内与体内DNA复制的不同之处：复制的不同之处：耐热的耐热的TaqTaq酶酶取代普通的取代普通的DNADNA聚合酶聚合酶 用用合成的合成的DNADNA引物引物替代替代DNADNA引物引物 温度的调节：温度的调节：变性、退火、延伸变性、退火、延伸 反复循环，可使反复循环，可使DNADNA无限扩增无限扩增 PCRPCR的第的第1 1个循环过程个循环过程 PCRPCR的第的第1 1和和2 2个循环过程个循环过程 PCR PCRPCR的第
6、的第3 3个循环过程个循环过程 PCRPCR技术的使用技术的使用 PCRPCR的标准反响程序：的标准反响程序：变性变性-复性复性-延伸延伸 1)DNA1)DNA模板的解链模板的解链变性变性 90 95 90 95，30s30s 理论上，在理论上，在9090左右能使左右能使DNADNA双链双链之间的所有氢键链断开，完全别离为单之间的所有氢键链断开，完全别离为单链；链；且在中性且在中性pHpH情况下，情况下，DNADNA的完整性仍的完整性仍能很好保存能很好保存 2)DNA 2)DNA 单链与引物的退火单链与引物的退火复性复性 55 65 55 65 ，3045s 3045s 引物与模板单链特异性结
7、合引物与模板单链特异性结合较较高的温度高的温度；不希望两条互补的模板单链结合在一起不希望两条互补的模板单链结合在一起DNADNA引物的量大大超过模板的量，竞引物的量大大超过模板的量，竞争性结合：引物争性结合：引物+模板几率模板几率DNADNA自身复自身复性性 几率几率 ;引物的最正确退火温度引物的最正确退火温度TmTm-5 5，引物的量引物的量 引物引物的长度的长度 3)3)引物的延伸引物的延伸新链新链DNADNA的合成的合成 7075 7075，3060s 3060s 2kb)0.5mM 10mM1 unit25 100 l3.影响影响PCR反响的因素反响的因素(最适条件最适条件 (1)(1
8、)模板：将要被复制的核酸片段模板：将要被复制的核酸片段 DNADNA或或RNARNARNAcDNARNAcDNA 较高的纯度：最好用纯化的较高的纯度：最好用纯化的DNADNA样品，样品，防止混有蛋白酶、核酸酶防止混有蛋白酶、核酸酶。用量适宜：用量适宜：102102105105分子数分子数100ng2kb2kb。(3)DNA(3)DNA聚合酶聚合酶 a.a.大肠杆菌聚合酶大肠杆菌聚合酶的的KlenowKlenow片断片断：不耐热，每次循环需重加酶。不耐热，每次循环需重加酶。c.c.其他聚合酶其他聚合酶 b.Taqb.Taq酶酶19881988年年：是从温泉耐高温细菌中提取的耐：是从温泉耐高温细菌
9、中提取的耐热性热性DNADNA聚合酶，其活性需要聚合酶，其活性需要Mg2+Mg2+。但但TaqTaq-DNADNA聚合酶有一定错配率聚合酶有一定错配率无无3 355外切酶外切酶活性，有活性，有5 533外切酶活性外切酶活性，为，为0.1%0.1%-0.25%0.25%3030次次cyclecycle；假设要细胞克隆；假设要细胞克隆PCRPCR扩增的产物，进行表达，扩增的产物，进行表达，扩增后必须测序证实才可使用扩增后必须测序证实才可使用 CharacteristicsDescriptionOriginMolecular weightOptimal temperatureActivityStab
10、ilityFidelityMg2+concentrationExonuclease activityTransferase activityThermus aquaticus strain YT194 kd72-80150 nucleotides/sec/molecule50%at 95 for 40 min1.110-4 substitutions per cycle0.5mM0.5mM 10mM1 unit25 100 l1 1、反应体系的优化、反应体系的优化 常用的常用的PCR技术技术 热启动热启动PCRPCR TDTD-PCR(touch down PCR,TDPCR(touch do
11、wn PCR,TD-PCR)PCR)巢式巢式PCRPCR 反向反向PCRPCR 锚定锚定PCRPCR 荧光定量荧光定量PCRPCR RTRT-PCRPCR 不对称不对称PCRPCR 1 1、热启动、热启动PCRPCR 热启动热启动PCRPCRhot start PCRhot start PCR是一种改进的是一种改进的PCRPCR方法，可有效防止非特异性扩增。方法，可有效防止非特异性扩增。将将DNADNA聚合酶与其他反响物隔绝，或是使用在高热聚合酶与其他反响物隔绝，或是使用在高热状况下才会活化的聚合酶，防止在未到达设定温状况下才会活化的聚合酶，防止在未到达设定温度前就开始反响。度前就开始反响。热
12、启动热启动PCRPCR有几种方式：有几种方式：蜡隔绝法：将除了聚合酶以外的反响物参加蜡隔绝法：将除了聚合酶以外的反响物参加PCRPCR管后，加滴管后，加滴熔融的石蜡；待石蜡凝固后再参加聚合酶。放入熔融的石蜡；待石蜡凝固后再参加聚合酶。放入PCRPCR仪开始仪开始反响升温后，石蜡融化浮至最顶层，聚合酶才与其他反响物反响升温后，石蜡融化浮至最顶层，聚合酶才与其他反响物混合。石蜡可同时作为防止蒸发用。混合。石蜡可同时作为防止蒸发用。热启动聚合酶热启动聚合酶化学型化学型：经过化学分子修饰的聚合酶，高：经过化学分子修饰的聚合酶，高热下结构改变而启动。热下结构改变而启动。热启动聚合酶热启动聚合酶抗体抗体：
13、带有针对聚合酶的免疫抗体，高热：带有针对聚合酶的免疫抗体，高热下使抗体别离而启动。下使抗体别离而启动。热启动聚合酶热启动聚合酶共价键结共价键结：改进自抗体型，使用小分子的：改进自抗体型，使用小分子的化合物，阻塞聚合酶作用位置，高温下别离。化合物，阻塞聚合酶作用位置，高温下别离。2、TD-PCR 即即touchdown PCRtouchdown PCR，降落，降落PCRPCR。指每一个指每一个或或n n个个循环降低循环降低11或或nn退火温度，直至退火温度，直至到达一个较低的退火温度到达一个较低的退火温度touchdowntouchdown退火温度退火温度。然后以。然后以此温度进行此温度进行10
14、10个循环。个循环。正确和非正确退火温度正确和非正确退火温度11差异将造成差异将造成PCRPCR产物量产物量4 4倍的差异，倍的差异，如果相差如果相差55，就会产生，就会产生4 4的五次方的五次方10241024倍的优势，因此，倍的优势，因此，相对于非正确产物，正确产物可以得到富集。相对于非正确产物，正确产物可以得到富集。退火温度起始在高于计算的退火温度起始在高于计算的TmTm值值1515左右，再接下来的循环左右，再接下来的循环中，退火温度以每次中，退火温度以每次1 1-22逐渐降低，直到逐渐降低，直到TmTm值以下值以下55，当，当到达特异的引物到达特异的引物-模板结合的模板结合的TmTm值
15、时，扩增就会开始。值时，扩增就会开始。当退火温度降到非特异扩增发生的水平时，特异产物会在当退火温度降到非特异扩增发生的水平时，特异产物会在与非特异扩增的竞争中胜出，成为主导的扩增产物防止非特与非特异扩增的竞争中胜出，成为主导的扩增产物防止非特异扩增产物的出现。异扩增产物的出现。此法扩增可利于此法扩增可利于PCRPCR产物纯化。产物纯化。TDTD-PCRPCR本卷须知本卷须知 由于目标是在较早的循环中防止低由于目标是在较早的循环中防止低TmTm值配对，在值配对，在TDTDPCRPCR中最好应用热启动技术。中最好应用热启动技术。设计时，退火温度的范围应跨越设计时，退火温度的范围应跨越1515左右，
16、从高于估左右，从高于估计计TmTm值至少几度到低于它值至少几度到低于它1010。3 3、巢式、巢式PCRPCR Nested PCRNested PCR 利用两套利用两套PCRPCR引物引物巢式引物巢式引物进行进行两轮两轮PCRPCR扩增反响。扩增反响。4 4、反向、反向PCRPCR PCRPCR只能扩增两端序列的基因片段，而反向只能扩增两端序列的基因片段，而反向PCRPCR那么可扩增中那么可扩增中间一段序列，而两端序列未知的基因片段。间一段序列，而两端序列未知的基因片段。方法：先用限制性内切酶酶切样品方法：先用限制性内切酶酶切样品DNADNA，然后用然后用DNADNA连接酶连接成一个环状连接酶连接成一个环状DNADNA分子，通过分子，通过反向反向PCRPCR扩增引物的上游片段和下游片段；扩增引物的上游片段和下游片段；反向反向PCRPCR可用于可用于 研究与研究与DNADNA区段相连接的未知染色体序列区段相连接的未知染色体序列染色体缓移或染色体步移染色体缓移或染色体步移。反向反向PCRPCR方法的缺乏方法的缺乏 需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种适宜的需要从许多酶中选择限制酶
