1、 448 Chin J Mod Appl Pharm,2023 February,Vol.40 No.4 中国现代应用药学 2023 年 2 月第 40 卷第 4 期 甘草黄酮醇降尿酸及抑制氧化应激作用及其机制研究 曹文洁1a,2，黄林生3，刘丽1a,2，钱永帅1a,2，余惠凡1a,1b,2，李飞1a,2*(1.湖北医药学院，a.药学院，b.生物医药研究院，湖北 十堰 442000；2.武当特色中药研究湖北省重点实验室，湖北 十堰 442000；3.湖北省十堰市太和医院肝胆胰外科，湖北 十堰 442000)摘要：目的 探究甘草黄酮醇(licoflavonol，LCF)降尿酸及抑制氧化应激作用及
2、其机制。方法 建立腺苷诱导肾小管上皮细胞 NRK-52E 的高尿酸细胞模型，给予 1.25，5，20 molL1 LCF，利用 HPLC 检测培养液中尿酸、次黄嘌呤、黄嘌呤、腺嘌呤、肌苷、腺苷含量。使用 15 mgdL1尿酸诱导 NRK-52E 细胞氧化应激损伤，同时给予 1.5，5，15 molL1 LCF处理 24 h，试剂盒测定细胞中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)活力及还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)及过氧化氢(H2O2)的含量。通过分子对接预测
3、LCF 与黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)的结合活性。进一步通过微量热泳动技术(microscale thermophoresis，MST)探究 LCF 和 XO的结合能力。结果 LCF 可降低腺苷诱导的细胞尿酸水平，提高尿酸诱导后细胞 SOD、CAT 的活力及 GSH 含量，并降低 H2O2、MDA 含量；分子对接结果显示 LCF 与 XO 之间结合能为9.1 kcalmol1，二者主要形成氢键，对应残基为 Thr-262、Glu-263；MST 结果表明两者间解离常数 Kd=(0.814 890.237 3)mmolL1。结论 LCF 可降低腺苷诱导的细胞尿酸水平并改
4、善高尿酸所致肾小管上皮细胞氧化应激损伤，其降尿酸作用机制可能与 XO 有关。关键词：甘草黄酮醇；高尿酸血症；黄嘌呤氧化酶；氧化应激；分子对接；微量热泳动技术 中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1007-7693(2023)04-0448-07 DOI:10.13748/ki.issn1007-7693.2023.04.003 引用本文：曹文洁,黄林生,刘丽,等.甘草黄酮醇降尿酸及抑制氧化应激作用及其机制研究J.中国现代应用药学,2023,40(4):448-454.Study on Effect and Mechanism of Licoflavonol on Reducin
5、g Uric Acid and Inhibiting Oxidative Stress CAO Wenjie1a,2,HUANG Linsheng3,LIU Li1a,2,QIAN Yongshuai1a,2,YU Huifan1a,1b,2,LI Fei1a,2*(1.Hubei University of Medicine,a.School of Pharmaceutical Sciences,b.Institute of Biomedicine,Shiyan 442000,China;2.Hubei Key Laboratory of Wudang Local Chinese Medic
6、ine Research,Shiyan 442000,China;3.Department of Hepatopancreatobiliary Surgery,Taihe Hospital,Shiyan City,Hubei Province,Shiyan 442000,China)ABSTRACT:OBJECTIVE To explore the effect and mechanism of licoflavonol(LCF)on reducing uric acid and inhibiting oxidative stress.METHODS The hyperuricemia cel
7、l model of renal tubular epithelial cells NRK-52E was induced by adenosine,1.25,5,and 20 molL1 LCF were administered,then the contents of uric acid,hypoxanthine,xanthine,adenine,inosine and adenosine in the culture medium were detected by HPLC.NRK-52E cells were treated with 15 mgdL1 uric acid to in
8、duce oxidative stress injury,1.5,5,and 15 molL1 LCF were administrated respectively for 24 h,the activity of superoxide dismutase(SOD),catalase(CAT)and the contents of glutathione(GSH),malondialdehyde(MDA)and H2O2 in the cells were determined by kits.The binding activity of LCF to xanthine oxidase(X
9、O)was predicted by molecular docking,and further investigated by microscale thermophoresis(MST).RESULTS LCF reduced the level of uric acid induced by adenosine,increased the activity of SOD and CAT and the content of GSH,decreased the content of H2O2 and MDA after uric acid induction.The molecular d
10、ocking results showed that the binding energy between LCF and XO was 9.1 kcalmol1,both were mainly formed hydrogen bonds,and the corresponding residues were Thr-262 and Glu-263.MST results showed that the dissociation constant Kd=(0.814 890.237 3)mmolL1.CONCLUSION LCF can reduce the level of cellula
11、r uric acid induced by adenosine and improve the oxidative stress damage of renal tubular epithelial cells induced by high uric acid.Its mechanism of lowering uric acid may be related to XO.KEYWORDS:licoflavonol;hyperuricemia;xanthine oxidase;oxidative stress;molecular docking;microscale thermophore
12、sis 基金项目：湖北省卫健委青年人才项目(WJ2021Q010)；湖北省教育厅科学研究计划项目(D20192101)；湖北医药学院研究生科技创新项目(YC2021038，YC2021039)；大学生创新创业计划项目(S202110929013，X202110929009)；湖北医药学院本科生科研训练计划(YSRTP202103)作者简介：曹文洁，女，硕士生 E-mail: *通信作者：李飞，女，博士，教授 E-mail:piaopodexinlifei 高尿酸血症(hyperuricemia，HUA)是由人体嘌呤代谢紊乱或尿酸排泄减少所导致的代谢性疾病，与痛风、慢性肾病、糖尿病等疾病有关1。
13、生理情况下，尿酸的生成和排泄处于一个动态平衡 中国现代应用药学 2023 年 2 月第 40 卷第 4 期 Chin J Mod Appl Pharm,2023 February,Vol.40 No.4 449 过程，若尿酸生成增多、排泄减少或二者共同作用引起尿酸代谢失衡，可导致 HUA2。2021 年数据显示，中国大陆 HUA 患病率为 16.4%，并且呈现出年轻化趋势3。HUA 已被认为是高血压、胰岛素抵抗、心血管病等疾病的独立危险因素4。尿酸是人类嘌呤代谢的终产物。腺苷被腺苷脱氨酶氧化成肌苷，肌苷进一步分解代谢成次黄嘌呤，次黄嘌呤随后被黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO
14、)转化为黄嘌呤，黄嘌呤被 XO 进一步转化为尿酸5。因此，腺嘌呤、腺苷、肌苷、次黄嘌呤、黄嘌呤是嘌呤代谢中重要的尿酸前体，XO是尿酸生成的限速酶6。目前，用于治疗 HUA 的药物主要分为抑制尿酸生成和促进尿酸排泄两类。别嘌呤醇和非布司他是临床上降尿酸的首选药物，但它们在降尿酸的同时产生了过敏、肝功能异常等严重的不良反应7-8，因此寻求疗效更好、不良反应小且具有肾保护作用的降尿酸药物是目前亟待解决的问题。氧化应激是指在各种刺激因素的作用下，机体内抗氧化防御机制失衡的一种反应状态，通常表现为产生大量的活性氧，以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(cat
15、alase，CAT)等抗氧化酶的活力降低9。正常生理水平的尿酸具有抗氧化作用，然而近年研究发现，高尿酸在体内外可诱导血管内皮细胞10、肝细胞11等靶细胞氧化应激，导致内皮细胞损伤和线粒体功能障碍。而对于高尿酸是否能引起肾小管上皮细胞氧化应激损伤，相关研究较少。据中国药典 2020 年版记载，甘草为豆科植物甘 草 Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀 果 甘 草G.inflate Bat.和光果甘草 G.glabra L.的干燥根和根茎12。研究表明，甘草黄酮类物质是甘草中最重要的活性物质之一，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、调节血糖等作用13，且甘草醇提物可通过抑制高尿酸血症
16、小鼠体内的 XO 活性和促进尿酸排泄有效降低小鼠血尿酸值14。甘草黄酮醇(licoflavonol，LCF)是乌拉尔甘草中的一种黄酮类化合物15，具有抗菌及抗病毒作用16，可抑制脂多糖诱导巨噬细胞 RAW264.7 的 NO 分泌17，发挥较好的抗炎作用。有研究发现，黄酮和黄酮醇类物质由于C2-C3 之间的双键而具有 XO 抑制活性18，因此LCF 在降尿酸和抑制氧化应激方面有很大的潜力。本研究通过探索 LCF 降尿酸的可能机制，期望为提供一种潜在的降尿酸候选药物奠定基础。1 仪器与试剂 大鼠肾小管上皮细胞 NRK-52E(美国ATCC公司)；LCF(成都曼斯特生物科技有限公司，批号：21020511；纯度：98.86%)；高糖 DMEM 培养液(批号：2315376)、胎牛血清(批号：1891605)均购自美国 Gibco 公司；链霉素(批号：3185C204)、胰蛋白酶(批号：0864C216)均购自美国 Amresco 公司；青霉素(中国 BBI 生命科学有限公司，批号：B206BA0010)；L-谷氨酰胺(批号：521J021)、XO(货号：X8020)均购自北京索莱宝科技有限
