1、DB65/T3621-2014白斑狗鱼嗜水气单胞菌败血症病原诊断规范1范围本标准规定了白斑狗鱼疑似细菌性败血症嗜水气单胞菌的采样程序、细菌鉴定方法与结果判定指标。本标准适用于新疆地区由致病性嗜水气单胞菌引起的白斑狗鱼败血症的诊断。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T4789.28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18652致病性嗜水气单胞菌检验方法SC/T7014水生动物检疫实验技术规范SC/T
2、7201.3鱼类细菌病检疫技术规程第3部分：嗜水气单胞菌及豚鼠气单胞菌肠炎病诊断方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1嗜胞菌(Aeromonas hydrophila)嗜水气单胞菌（Acromonas hydrophila，简称Ah）隶属于气单胞菌科(Aeromonadaceae)，气单胞菌属(Aeromonas),嗜水气单胞菌亚种；嗜温性、有运动力，是气单胞菌属的模式种。嗜水气单胞菌为细胞短杆状，两端圆形，至球菌状，直径1.0Am4.4m;单个、成对或成链状；以极生鞭毛运动，一般单鞭毛；革兰氏阴性，氧化酶阳性。嗜水气单胞菌能导致鱼、鳖、牛蛙以及蚌等水生动物的败血症及局部感染，人类
3、可因水气单胞菌感染而发生腹泻、食物中毒、继发感染。经常从土壤、淤泥、污水、淡水以及人类粪便中分离到，是一种典型的人-兽-鱼共患病病原。3.2鱼类细菌性败血症鱼类细菌性败血症又称细菌性出血病、腹水病、出血性腹水病、出血病等，作为暴发性流行病其危害最重，流行最广，周期最长，殃及的鱼类品种最多，死亡率也最高，患此病的鱼从发现症状到死亡仅3天5天，短期内会造成大幅度死鱼，甚至绝产，是池塘养殖的恶性病害。病原为嗜水气单胞菌等多种细菌感染引起，发病的原因是由于鱼池多年未清塘、淤泥厚、水质恶化，致使病原菌、寄生虫大量孳生。特别是高温季节，长期不关注水质调控，造成鱼池的氨氮、亚硝酸盐含量很高，可诱发该病。突然
4、地大量换水或暴雨造成大量外源水进入可诱发疾病。鱼体体质下降也是致病原因之一。4试剂和材料DB65/T3621-2014检验中所需试剂、染色液与培养基的配制按GB/T4789.28、GB/T18652或SC/T7014中的规定执行；聚合酶链式反应(PCR)测定用灭菌双蒸水应符合GB/T6682中一级水的规格，且要用焦炭酸二乙酯(DEPC)处理水，上述未提及的见附录A。16SrRNA基因DNA序列扩增引物，P1:5-GAGGAGGAAAGGTTGATGCC-3,P2:5-CTTGAGTTCCCACCATTACG-3。5设备和器械超净工作台、生物显微镜、PCR仪、电泳仪、离心机、微生物检测必备辅助设
5、备（包括生化培养箱、恒温摇床、-4/-20冰箱等)和器械（包括培养皿、试管、酒精灯、接种环、离心管等）等。6白斑狗鱼嗜水气单胞菌败血症初诊6.1鱼群及个体活动症状由嗜水气单胞菌引起败血症的患病鱼表现为：春、夏、秋季易于发病，当年鱼种表现尤为严重，一般在发病初期食欲减退，行动迟缓，多游弋在出水口附近，鱼群摄食量明显降低，高峰期大量死亡。6.2外观变化初期体表无明显症状；随后，体表局部皮肤及肌肉组织发炎，病灶软化，向外隆起，体表有明显病灶，与其它鱼类的疖疮病有相似症状，鱼体患处皮肤炎性充血，体色呈斑块状褪色，鳞片部分脱落，轻微水肿；严重者，在体表多处出现明显的“烧灼”样斑块，与体色相比呈淡黄色的病
6、灶，温度低时常伴随继发性水霉病。病灶主要分布在头后背部、背鳍基部前段体两侧、躯干部两侧，病灶皮肤鳞片脱落严重，肌肉向外隆起，手压有柔软浮肿感觉，有软化现象，皮下肌肉发炎，形成感染病灶，继而发生坏死、溃烂。切开患处，可见肌肉溶解。部分感染病例，胸鳍基部充血，末端腐烂，有的尾鳍鳍条间组织被破坏，鳍条呈扫帚状。6.3剖检病变患病鱼鳃颜色变淡、整体呈花斑状、末端肿胀腐烂，边缘不整齐；剖检流出大量淡黄或者红色腹水；肌肉充血，肌纤维明显肿胀断裂；肝脏肿大，颜色变淡，有充血、出血，肝组织严重坏死；肾脏肿大、易碎，肾小管绝大部分坏死，细胞破裂，胞浆呈红色团块状流失于管腔；脾脏肿胀充血、颜色加深，细胞大量坏死，髓质内含铁血黄素沉积。7嗜水气单胞菌的分离与培养7.1待检样本的采集无菌条件下，取发病或濒死鱼的肝脏、肾脏、脾脏、心脏内血液、病灶组织及周围肌肉组织等。首先体表无菌水冲洗，再用75%酒精棉球擦拭鱼体表消毒；无菌操作解剖后各组织器官取样。7.2分离与纯培养7.2.1将取样组织常规方法划线接种于血琼脂培养基（按GB/T4789.28中4.6规定的方法配制）上。28培养24h48h。2
