1、YY/T0127.10-2001前言本标准主要依据GB15193.4一1994食品安全性毒理学评价程序和方法以及GB7919一1987化妆品安全性评价程序和方法而制定。本标准废除并代替YY91042一1999牙科复合树脂充填材料附录AA3鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验(Ames试验)。本标准与前版标准在主要技术内容上无差别，仅对操作步骤操作予以细化，并进行了编辑性修改。本标准为YY0268一1995口腔材料生物学评价第1单元：口腔材料生物性能评价导则提供了具体的试验方法。本标准从实施之日起，同时代替YY91042一1999牙科复合树脂充填材料附录AA3鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验(Ames试验)
2、。本标准的附录A是标准的附录。本标准由国家药品监督管理局提出。本标准由全国口腔材料和器械设备标准化技术委员会归口。本标准由国家药品监督管理局北医医疗器械质量监督检验中心负责起草。本标准主要起草人：林红、刘文一、李盛琳。YY/T0127.10-2001试管或菌种管内，经干冰丙酮液（一75）或液氮（一196）速冻，在一80冰箱或一196液氮中长期贮存。5.3增菌培养从冷冻贮存菌株管中刮取细菌置5mL营养肉汤培养基中，经37振荡(100次/min)培养1012h,活菌数应达10个/mL(或OD6o0.4)，细菌培养液从37取出后，应立即放人冰浴中备用，试验需用当天孵育好的新鲜细菌。5.4菌株鉴定5.
3、4.1组氨酸需求(his一)试验凡组氨酸营养缺陷型试验菌株只能在补充组氨酸的培养基上生长，而在缺乏组氨酸的培养基上不能生长。鉴定方法：在底层培养基平皿表面加人0.5mmol/LL-组氨酸0.1mL和0.5mmol/LD-生物素0.1mL。用L棒铺开。对照平皿只加生物素不加组氨酸。用白金耳浸细菌培养液，在对照平皿和含有组氨酸/生物素的平皿表面分别平行划线。四株细菌可划在同一个平皿上，经37孵育24h后，观察细菌生长情况。试验菌株在含组氨酸平皿上生长，在对照平皿上不应生长。5.4.2脂多糖屏障缺陷鉴定(rfa突变)粗糙型突变的微生物，其细胞表面一层脂多糖屏摩已经破坏，因此一些大分子物质能穿过菌膜进
4、人菌体内而抑制其生长。野生型菌株或含gl缺失的菌株则不受影响。鉴定方法：分别将每种细菌培养液0.1mL加到452mL顶层培养基试管内，混匀后倾倒于营养琼脂培养基平皿表面，使其均匀分布。待固化后，取直径为6m无菌滤纸圆片浸1mgmL结晶紫溶液10L,放到平皿中央。经37瓣育24h后，围绕圆纸片公魏透明的抑菌环（直径大约14mm),说明此菌存在深粗型(rfa)突变。TA97、TA98、TA100、TAU2均有抑菌环。野生型鼠伤寒杆菌无抑菌环。5.4,3对紫外线敏感性鉴定(uvrB修复缺陷型的釜定)具有uvB修复缺陷型的试验菌株，在紫外线照射后仍能照常生长，借此证明uvrB突变的存在。鉴定方法：用白
5、金耳浸细菌培养液，左苍养琼脂培养基平皿表面平行划线，四株细菌可划在同一平皿上.用黑纸覆盖平皿一半，在距离33ct处用15W紫外线杀菌灯照射平皿8s,经37孵育24h后观察结果。对紫外线敏感的菌株(TA97、TA98、TA100)只在未照射过的一半平皿上生长。而具有uvrB修复缺陷型的菌株(TA102)在紫外线照射（未盖黑纸的另一半平皿）后仍能生长。5.4.4抗氨苄青霉素(PKM101)试验（菌株R因子丢失鉴定）含R因子的试验菌株对氨苄青霉素具有抗性。R因子不稳定容易丢失，从而使试验菌株丧失R因子的特性，故需鉴定R因子是否存在。鉴定方法1：用白金耳浸细菌培养液，在含氨苄青霉素平皿表面平行划线，四
6、株细菌可划在同一平皿上。还应选用一个无抗性因子的菌株，以测定氨苄青莓素的效应。经37孵育24h后，无抗性因子菌株不应生长。鉴定方法2：用白金耳浸细菌培养液，在营养琼脂培养基平皿表面平行划线，四株细菌可划在同一平皿上。将沾有氨苄青幕素溶液的滤纸条与划线交叉放置，37孵育24h。如滤纸条周围细菌生长正常，说明试验菌株具有R因子。5.4.5四环素(PAQI)抗性的鉴定鉴定方法1：用白金耳没细菌培养液，在含氨苄青霉素/四环素平皿表面平行划线，四株细菌可划在同一平m上。经37孵育24h后，对四环素有抗性的TA102菌株能生长，对四环素无抗性的菌株不生长。鉴定方法2：用白金耳浸细菌培养液，在营养琼脂培养基
7、平皿表面平行划线，四株细菌可划在同一平皿上。待干后，吸取四环素(8mg/mL)溶液与菌株划线处交叉划线，37解育24h。对四环素有抗性的TA102菌株能生长，其他菌株不生长。2YY/T0127.10-20015.4.6自发回变数(his+)的测定在小试管中加入融化的顶层培养基2L,分别加人待测菌株的菌液0.1mL,迅速在高速液体混合器上混匀，倾倒在已固化的底层培养基平皿上，使其均匀分布。待固化后，经37解育48h,计数全部菌落数。一个菌株应做23个平皿，以便计算平均菌落数。必要时可重复试验，以保证回变菌落数值在个恒定的范围。各试验菌株的自发回变数分别为：TA97(97180);TA98(156
8、0):TA100(75200):TA102(240360)。加过S-9的菌株，自发回变数稍有增加。5.4.7对阳性突变剂的敏感性鉴定使用已知阳性对照剂，检查试验菌株的敏感性是否降低，其方法同7。6代谢活化剂大鼠肝微粒体酶(S-9)的诱导和制备61大鼠肝微粒体酶(S-9)的诱导选用体重150200g的健康雄性S-D大白鼠或体重110150g的Wistar大鼠。将多氯联苯(Aroclor1254或国产PCB-五氯)溶于玉米油中，浓度为200mg/mL,腹腔一次注射500mg/kg(体重)。第6天用颈动脉排空血液法处死，处死前12h禁食不禁水。6.2切取肝脏处死的大鼠经过无菌处理，打开腹腔，用20m
9、L0.15mol/L氯化钾溶液(4)进行肝门静脉灌注后，小心分离并将肝脏完整取出，整个过程应在无菌室中进行。离体以后的肝脏始终保持4C以下无菌操作。6.3S-9的制备制备S-9的一切器皿均应消毒，全部操作在冰水浴平行。肝脏称重后，在0.15mol/L氯化钾溶液中洗涤数海。每克重肝脏加0.15mol/I氯化钾溶液3mL。用剪刀剪碎肝脏，放人组织匀浆机中，以4000r,min匀浆2min。将匀浆液放人低温(04)高速离心机上，以9000g离心10min,其上层液即SS,6.4S-9贮存吸取2mL上层液分装于小试管或安甑中。在密封的条件下，用干冰丙酮液速冻后，贮存于一80C冰箱或液氨容器中。保存期不
10、超过一年。6.5S9鉴定S-9制备后，应进行下列测定：a)无菌检查；b)蛋白含量测定(Lowry法)：每毫升蛋白含量应不超过40mg。c)细胞色素P-450测定：S-9活力还必须以标准致癌物进行测定。6.6S-9的剂量选择首先使用标准浓度的S-9混合液，测定其对已知阳性致癌物的生物活性，确定最适用量。如果是阴性结果，还应使用高浓度的S-9混合液重新试验。6.7S-9混合液制备：见附录AA8。7受试样品的制备试样制备可选用生理盐水、二甲基亚砜(DMSO)或其他溶剂（毒性剂量以下），无论选用何种溶剂，均应无诱变性。将材料制备成溶液、混悬液或浸提液。浸提液制备按YY/T0127.2规定的方法进行。7.1受试样品剂量选择预试验用菌株TA100进行预试验（操作程序应与正式试验一致），以了解受试样品对细菌的毒性。
