1、优选菌株对三种有机磷农药降解效率的研究 余云涛 宋泱 王 凯 指导老师 曾国寿 从被农药污染的土壤采集样品，在不同农药浓度下富集耐农药的微生物。对菌株进行别离与筛选、耐农药能力的测定、菌落计数，优选了耐药能力较高的A、B、C、E、F、G六个菌株，并对菌株进行了微生物学鉴定。研究了这六个菌株的降解有机磷农药情况，结果说明：菌株C对辛硫磷的耐受性较强，但A和E对辛硫磷的降解率较高，48hr后的降解率到达了65.6%和76.1%；菌株B、C对甲基异柳磷的耐受能力较强，但菌株E、F和A对甲基异柳磷的降解活性较强，48hr后的降解率分别为77.5%、74.5%和63.8%；菌株E对.水胺硫磷的降解活性最
2、高，48hr后降解率高达91.2%。采用A，E，F混合菌株接种培养48hr，对辛硫磷，甲基异柳磷，水胺硫磷的降解率分别为82.3%，84.7%，93.5%。6个菌株的对硫磷水解酶基因PCR结果说明，菌株A、C、F、G四株芽孢杆菌能扩增出预期的900bp条带。细菌破碎液对有机磷农药的降解及其pH值的实验结果说明，E菌株内含有降解有机磷的酶，不属于已被克隆的对硫磷水解酶，它的基因序列至今未见报道；建议改为：E菌株内含有降解有机磷的酶，但未能扩增出对硫磷水解酶的900bp条带，所以它可能由其他的酶参与有机磷的降解。B菌株耐受性很强，其B菌株内不含对硫磷水解酶改为：但同样未能扩增出900bp的条带。E
3、的较适pH为7.2，A、B、F的较适pH为8.0。关键词 优选菌株 有机磷农药 降解效率引言有资料说明我国每年有机磷农药的使用量约为8万吨。它们的广泛使用是造成环境污染和食品污染并威胁人类生存与可持续开展的主要原因之一，并成为兴旺国家贸易绿色壁垒的重要手段1。在土壤和水体中，微生物对有机磷农药的降解起着重要的作用24。因此，驯化和别离具有高效降解有机磷农药的微生物，并探讨农药污染的生物修复的可能性，消除农药污染，净化环境具有重要的现实意义。1 材料和方法1.1 细菌的富集 从厦门后坑菜园地分别采集施用过辛硫磷、多菌灵和敌敌畏的土样三份。分别取1g土样参加100 mL含有10 ppm、50 pp
4、m、100 ppm辛硫磷乳剂的LB培养基牛肉膏3 g，蛋白胨10 g ，NaCl 5 g，蒸馏水 1000 mL，pH 7.07.2中，28震荡培养48 hr，以富集耐受或分解辛硫磷的细菌。1.2细菌的别离与筛选 上述富集后的培养物以倾注法别离单菌落。别离后的细菌分别接种到含100 ppm、200 ppm和500 ppm的辛硫磷、甲基异柳磷和水胺硫磷LB平板上，28恒温箱中培养3天后，观察细菌的生长情况，选择耐受谱广、耐药性强、生长旺盛的菌株。进一步考察验证采用含上述不同浓度的不同农药的LB斜面培养基，28培养3天。1.3耐药能力的测定上述筛选后得到的菌株，进一步考察了它们在不同农药浓度下的生
5、长情况。在含有100 ppm、200 ppm、500 ppm、1000 ppm、1500 ppm的甲基异柳磷、辛硫磷乳剂、水胺硫磷的液体LB中参加1 mL菌悬液，28震荡培养48 hr后，以蒸馏水为空白，以无接菌的含不同浓度的不同农药的LB液体培养基为对照，测定OD600。1.4菌落计数实验 用5mL无菌水洗下菌苔，取1 mL菌悬液参加9 mL含有浓度为100 ppm、200 ppm、500 ppm、1000 ppm辛硫磷的液体LB培养基中，摇均后放在28摇床中培养3天后，稀释10-6、10-7倍，分别取稀释液0.1 mL至培养皿中，倒入温的固体LB培养基摇匀，在28恒温箱中培养3天后，观察各
6、平板中菌落的生长情况，记录菌落数量、大小、颜色和形态，得出各个细菌的耐受浓度范围。1.5菌株的鉴定 1.5.1菌落形态观察 在LB平板上划线，培养后观察菌落形态。1.5.2 革兰氏染色和镜检 经革兰氏染色后，以枯草芽孢杆菌和大肠杆菌为对照，油镜观察。1.5.3 BioLog MicroLog3自动微生物鉴定系统鉴定：将活化后的细菌接种于LB平板，产芽孢菌株需进行十字划线培养。30培养18hr后，以无菌棉签将不产芽孢菌株菌落从平板上轻轻抹下，悬浮于预加19 mL GN/GP-IF0.4.% NaCl、0.03%聚醚 F-68、 0.02% Gellan Gum接种液的Turbidity Stan
7、dardBioLog公司浊度管中, 在Turbidimeter 浊度计 BioLog公司上测定比浊为20%T；以无菌竹签将产芽孢菌株菌苔轻轻刮下，注意选取接种十字外侧菌苔，将挑下菌苔涂布于干的Turbidity Standard浊度管内壁，并将其尽量涂布成膜状，参加19 mL GN/GP-IF接种液，测定比浊为28%T。将接种液接种于MicroPlate GP2 培养板 BioLog公司上，每孔150L。将培养板置28培养4 hr及24 hr后，在MicroLog3 MicroStation Reader 读数仪 BioLog公司上读数，以随机GP Database数据库分析。1.6农药降解速
8、率的分析 将一支斜面上的菌苔用5 mL LB培养基洗下后，全部接种到45 mL含有100 ppm农药甲基异柳磷、辛硫磷乳剂、水胺硫磷的LB培养基中，28震荡培养，一定时间取样2.5 mL，测定OD600后，6000 r/min离心10min，得上清液和沉淀，清液用蒸馏水定容到25 mL，沉淀用蒸馏水悬浮后经超声波破碎，再定容到25 mL，两种样品分别经涂有100 m/L PDMS的固相微萃取头萃取15 min，用气相色谱法5分析农药残留量。1.7混合菌对农药降解率的分析将A,E,F菌种斜面分别用5 mL LB培养基洗下后混合,按每瓶接5 mL量接入各个三角瓶中,各个三角瓶分别含有100 ppm
9、的甲基异柳磷或辛硫磷或水胺硫磷，28摇床培养48 hr，按上述1.5方法分析。1.8细菌DNA的提取细菌过夜培养后取1.5 mL，4000 r/min离心2 min。沉淀参加567 L的TE缓冲液，充分悬浮；参加30 L10%的SDS和3 L 20 mg/mL的蛋白酶K，混匀，371 h；参加100L 5 mol/L NaCl,充分混匀，再参加80 LCTAB/NaCl溶液，混匀，65 10 min；参加等体积的氯仿/异戊醇，混匀，5000 r/min离心5 min，将上清转入一新离心管；参加等体积酚/氯仿/异戊醇，混匀，5000 r/min离心5 min，取上清于另一离心管，参加0.6倍体积
10、的异丙醇，轻轻混匀，15000 r/min离心20 min，去上清，沉淀溶解于100 L的无菌重蒸水中。1.9 PCR扩增引物序列78为：引物1：5端引物5 3引物2：3端引物5 3由上海生工生物工程合成。PCR条件为：0.5 mL的离心管中参加：5L 10XPCR缓冲液 各5L的0.5mol/L的引物1和引物2 5L模板DNA 5LdNTP4种，每种各2 mmol/L 1L Taq DNA聚合酶5 U/L 加水至50 L混匀，97 5 min后，92，30 s；60，30 s；72，3 min；35个循环；4。1%琼脂糖电泳，EB染色，观察，拍照。1.10 细菌破碎液对有机磷农药的降解及其p
11、H值的关系1.10.1材料A、B、E、F四种菌在LB液体培养基培养24 h各50 mL 辛硫磷、甲基异硫磷、水胺硫磷参加Tris缓冲液pH值7.2100 ppm各100 mL Tris缓冲液pH值7.21.10.2仪器 TY92-II超声波细胞粉碎机宁波新芝生物科技股份，TDL-5离心机，数显恒温水浴锅常州国华电器，722智能分光光度计厦门分析仪器厂。1.10.3 实验方法取四种菌各50 mL离心1000 r/min 10 min，离心后弃沉淀留上清液。第二次离心4000 r/min 10min，离心后弃上清液留沉淀菌泥。将四种菌泥分别参加pH 7.2 Tris缓冲液25mL，在细胞粉碎仪粉碎
12、。破碎后简称为A、B、E、F细胞破碎液，镜检均未见完整细胞。细菌破碎液对有机磷农药的降解实验。将农药分组：每种农药分为灭酶、室温、40、50四组，每根试管各参加100 ppm农药2.5 mL；然后分别参加A、B、E、F细菌破碎液0.5 mL。均匀震荡、观测浑浊度后，放入水浴锅内培养45 min，之后测定各组的OD值变化，灭酶先将细菌破碎液于100煮沸3 min后，参加0.5 mL破碎液，置室温反响45 min。在不同pH值下细菌降解酶作用的实验。选择四种菌降解农药的最正确温度50或40，分为pH5.0、6.0、7.2、8.0、9.0和灭菌后pH7.2对照六组。每组含缓冲液2.5 mL，破碎液1
13、 mL。在水浴锅里培养45min后测定各组OD值的变化。2 结果与分析2.1 细菌的富集、别离与筛选2.1.1 细菌的富集从厦门市后坑菜园地采集到的分别施用过辛硫磷、敌敌畏和多菌灵的土样三份，分别在10ppm、50ppm和100ppm辛硫磷浓度下富集48hr后，测定OD600值，结果说明图1，无论是辛硫磷、敌敌畏还是多菌灵污染的土样，均有微生物的生长。在三种辛硫磷富集浓度下，微生物生长的差异较大，10ppm辛硫磷浓度下，OD值到达了0.84。浓度ppmOD图1富集瓶中菌的生长情况2.1.2 细菌别离和筛选 上述富集后的培养物经平板倾注别离，挑选菌落形态，颜色各异的16个菌落至斜面培养基。对这1
14、6个菌株，我们进一步考察了它们在100ppm、200ppm和500ppm的多菌灵、辛硫磷和甲基异柳磷浓度下的耐药情况，结合显微观察，最终选择了在各种浓度的农药中都能生长的7个菌株作进一步的研究。重新编号为A、B、C、D、E、F、G。2.2 耐药能力的测定为进一步考察A、B、C、D、E、F、G 7个菌株的最高耐药活性，我们将这7个菌株分别接种在含100 ppm、200 ppm、500 ppm、1000 ppm、1500 ppm的甲基异柳磷、辛硫磷乳剂和多菌灵的液体LB在液体培养基中，培养2天，测定OD600值。结果说明，菌株C耐辛硫磷的能力最强，到达了1000 ppm；菌株D耐辛硫磷的能力最差，100 ppm下，OD值也仅为0.468；其它菌株在被抑制的浓度在500 ppm至1000 ppm之间表1。菌株B、C对甲基异柳磷的耐受能力较强，在1500 ppm下仍没有明显的被抑制，菌株D的耐受能力最弱，其他菌株被抑制的浓度在200 ppm1000 ppm之间表2。六种菌株对于水胺硫磷的耐受性都很强表3。对于不同浓度的不同农药而言，这七个菌株都能生长，只是生长速率发生明显差异。其中为100、200ppm最好，由于D号菌生长最差，留A、B、C、E、F、G 六个菌株供进一步实验。表1不同辛硫磷浓度下的菌体生长OD 浓度值ppm菌株10020050010001
