1、细胞培养基础篇基础篇-无菌操作基本技术 1. 实验进行前,无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌,以70% ethanol擦拭无菌操作抬面,并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后,才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株,且即使培养基相同亦不共享培养基,以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后,将实验物品带出工作台,以70% ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后,再进行下一个细胞株之操作。 2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞,必要物品,例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置,其它实验用品用完即应移出,以利于气
2、流之流通。实验用品以70% ethanol擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域,勿在边缘之非无菌区域操作。 3. 小心取用无菌之实验物品,避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口,亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后,以手夹住瓶盖并握住瓶身,倾斜约45角取用,尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 4. 工作人员应注意自身之安全,须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作,并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中,应避免引起aerosol(悬浮颗粒)之产生,小心毒性药品,例如DMSO及TPA等,并避免尖锐针头之伤害
3、等。 5. 定期检测下列项目: 5.1. CO2钢瓶之CO2压力。5.2. CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水,每周更换)。 5.3. 无菌操作台内之airflow压力,定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜,预滤网(300小时/预滤网,3000小时/HEPA)。6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750),定期更换水槽的水。基础篇-实验用品 1. 种类:1.1. 细胞培养实验用品均为无菌,除了玻璃容器与pasteur pipet(巴斯的吸管)外,其它均为塑料无菌制品。 1.2. TC级培养盘表面均有coating高分子物质以让细胞吸附,培养容器种类有Tfl
4、ask,plates, dishes, roller bottle等,依实验需要使用。 1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml 1.4. 塑料离心管:15 ml, 50 ml,均有2 种不同材质,其中polypropylene (PP)为不透明材质,polystyrene (PS)为透明材质,可依实验需要而选择适合材质之离心管。 1.5. glass pastuer pipet: 9 inch,用以抽掉废弃培养液等。 1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware):100ml,250ml,50
5、0ml,1000ml。2. 清洗:2.1. 新购玻璃血清瓶先以0.10.05 N HCl 浸泡数小时,洗净后才开始使用。 2.2. 用过之玻璃血清瓶,以高压蒸汽灭菌,洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干净,勿加清洁剂清洗。3. 灭菌:3.1. 实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖,高压蒸汽灭菌121, 15 lb, 20 分钟,置于oven中烘干。 3.2. 实验用玻璃pasteur pipet以干热灭菌170, 4 小时。 3.3. 液体或是固体废弃物可用10 % hypochloride溶液(次氯酸,即漂白水) 或是蒸汽高压灭菌121 , 15 lb, 20 分钟处理。 基础篇-培养基 1.
6、液体培养基贮存于4 冰箱,避免光照,实验进行前放在37 水槽中温热。 2. 液体培养基(加血清)存放期为六个月,期间glutamine可能会分解,若细胞生长不佳,可以再添加适量glutamine。3. 粉末培养基配制(以1 升为例): 3.1. 细胞培养基通常须添加10%血清,因此粉末培养基之配制体积为900 ml,pH为7.2-7.4。NaHCO3 为另外添加,若将NaHCO3粉末直接加入液体培养基中会造成pH之误差,或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3粉末应分别溶解后才混合,然后用CO2气体调整pH,而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH),因为氯离子对细胞生长可能有影响,且贮存时培养基
7、的pH易发生改变。 3.2. 材料: 纯水(milli-Q水或二次至三次蒸馏水,水品质非常重要),粉末培养基,NaHCO3,电磁搅拌器,无菌血清瓶,0.1或0.2 mm无菌过滤膜,pH计,真空泵,CO2气体 3.3. 步骤: 3.3.1. 取粉末培养基溶于700 ml milli-Q水中,搅拌使其溶解。 3.3.2. 称取适量之NaHCO3粉末溶于200ml milli-Q水中,搅拌使其溶解,然后通入CO2 气体至饱和,约3-5分钟。 3.3.3. 将溶解且含饱和CO2之NaHCO3溶液加入溶解之液体培养基中混合。混后溶液之pH应为7.2-7.4,除非pH值偏差太大,否则不需用酸碱再调整之。若
8、为太碱,可再通入CO2气体调整pH。培养基以真空帮浦通过过滤膜时,pH会升高0.1-0.2。3.3.4. 以0.1或0.2 mm 无菌过滤膜过滤灭菌,同时分装至无菌容器中,标示培养基种类、日期、瓶号等,贮存于4。(血清亦可加入培养基中一起过滤)3.3.5. 配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。 附-配制培养基之生长测试 材料: MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004) 6-well TC plate (or 35 mm TC dish) methanol glacial acetic acid 10 % Giemsa solution (GibcoBRL 10
9、092-013) 步骤: 1. 以待测试培养基培养MDCK cell,接种MDCK 细胞于6-well plate (或35mm TC dish) 中,每个well 接种1 102 活细胞,同时作对照组实验。 2. 接种57 天后,在100 倍倒立显微镜作观察细胞群落之生长,待细胞群落大到可以肉眼观察,而群落间不互相接触时即可。 3. 去除培养基,加入1 ml Carnoys 固定液(甲醇:冰醋酸 3:1),室温下静置10 min。 4. 去除固定液,水洗二次。 5. 加入1 ml 10 % Giemsa solution,室温下静置染色2-3 min。 6. 去除染液,水洗二次。 7. 以肉
10、眼计数群落数,并比较之,若新配制或新批号的培养基对细胞生长不佳,则丢弃之。 基础篇-抗生素 1. 细胞库之细胞培养基不加抗生素 1.1. 培养自ATCC 引进之细胞株,培养基中不加抗生素。 1.2. 培养自其它实验室引进之细胞株,制作token freeze前培养基须添加抗生素,待token freeze通过污染测试后,大量培养时则不加抗生素。2. 寄送活细胞时,须将培养液充满整个flask时,则须添加抗生素(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)。 3. 若要检测mycoplasma(支原体),则培养基内不可添加gentamicin
11、(庆大霉素),因gentamicin会抑制mycoplasma生长。 4. 去除细菌污染之抗生素混合配方:penicillin 250units/ml, streptomycin 250ug/ml, neomycin新霉素 250ug/ml, bacitracin枯草杆菌抗生素 2.5units/ml,注意混合使用后药物毒性会增强。 5. 抗生素使用种类与浓度: 工作浓度. 储存温度. 杀灭细菌 Penicillin(青霉素) 100 units/ml -20 G(+) bacteria Streptomycin(链霉素) 100 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteri
12、a chlotetracycline 50 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria (chloramphenicol 氯霉素)gentamicin(庆大霉素) 50 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria, mycoplasma amphotericin B两性霉素B 2.5 ug/ml -20 yeast and molds霉菌 nystatin 制霉菌素 50 ug/ml -20 yeast and molds fungizone两性霉素B 2.5ug/ml -20 yeast and molds 基础篇-血清 1. 血清必须贮存于207
13、0,若存放于4,请勿超过一个月。如果一次无法用完一瓶,可将4045ml 分装于无菌50ml离心管中,由于血清结冻时体积会增加约10 %, 必须预留此膨胀体积之空间,否则易发生污染或容器冻裂之情形。 2. 一般厂商提供之血清为无菌,不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物,则可将血清加入培养基内一起过滤,勿直接过滤血清。3. 瓶装(500ml) 血清解冻步骤(逐步解冻法):20或70至4冰箱溶解一天,至室温下全溶后再分装,一般以50ml无菌离心管可分装4045 ml。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡),使温度与成分均一,减少沉淀的发生。勿直接由20直接至37解冻,因温度改变太大,容易造成
14、蛋白质凝结而发生沈淀。 4. heat-inactivation(热灭活) 是指56, 30 分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均匀。此热处理之目的是使血清中之补体成份(complement) 去活化。除非必须,一般不建议作此热处理,因为会造成沉淀物之显著增多,且会影响血清之品质。补体参与之反应有:cytolytic activities(溶细胞活动), contraction of smooth muscle(平滑肌收缩), release of histamine from mast cells and platelets(组氨从肥大细胞和血小板中释放), enhanced p
15、hagocytosis(增强吞噬作用), chemotaxis and activation of lymphocytic and macrophage cell type(淋巴细胞和巨噬细胞细胞形态的趋化和激活)。 5. 勿将血清置于37太久,若在37放置太久,血清会变得混浊,同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏,而影响血清之品质。 6. 血清之沉淀物 6.1. 凝絮物:发生之原因有许多种,但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成,这些凝絮沉淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沉淀物,可用离心3000rpm, 5min去除,或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沈淀物,因为会阻塞过滤膜。6.2. 显微镜下观察之“小黑点”:通常经过热处理之血清,沉淀物的形成