1、TRIzol法同时提取RNA,DNA,蛋白质TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol试剂有多组分分离作用,与其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特点是可同时分离一个样品的RNADNA蛋白质TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。 TRIzol试剂可用于小量样品（50-100mg组织、5106细胞）也适用于大量样品（1g组织、1
2、07细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，可同时处理大量不同样品，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern Blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无RNase的DNase处理RNA样品，避免出现假阳性。共纯化的DNA可用作标准，比较不同样品RNA的得率，也可用于PCR和酶切。蛋白质可用于Western Blotting。 规格：100ml 黄色透明液体 储存条件：2-8避光保存12个月 注意：请勿直接接触皮肤或吞咽，以免灼伤。如接触皮
3、肤应立即用洗涤剂和大量水冲洗。忌用乙醇擦洗，乙醇会加重灼伤程度。 预防RNase污染注意事项： 1.经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。 2.使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。 3.RNA在TRIzol试剂中时不会被RNase污染，但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150烘烤4小时，塑料制品可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，高压灭菌，即可去除RNase。 4.配制溶液应使用无RNase的水（将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.01v/v,放置过夜,高压灭菌。注：DEP
4、C有致癌之嫌，需小心操作。）RNA的提取 准备试剂：氯仿，异丙醇，75乙醇，无RNase的水或0.5SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制) 操作步骤: 1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10。 b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。 c细胞悬液 离心收集细胞，每5-10106动物
5、、植物、酵母细胞或1107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。 2将匀浆样品在室温（15-30）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。 3可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-810000g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。 5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。 6. 2-810000g
6、离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60。 7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。 8. 2-810000g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。 9. 用75乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75乙醇。2-8不超过7500g离心5分钟，弃上清。 10.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟
7、即可.不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25-200l无RNase的水或0.5SDS,用枪头吸打几次,55-60放置10分钟使RNA溶解.如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。RNA也可用100的去离子甲酰胺溶解，-70保存。 注意事项： 1.从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800ml TRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10g RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。 2匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70
8、保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8一星期以上或-5至-20一年以上。 3分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机，2600g离心30-60分钟。 预期产量：1mg组织或1106细胞提取RNA分别为： 肝和脾6-10g ,肾3-4g ,骨骼肌和脑组织1-1.5g ,胎盘1-4g ,上皮细胞8-15g ,成纤维细胞5-7g 。 常见问题分析： 得率低：A.样品裂解或匀浆处理不彻底 BRNA沉淀未完全溶解 A260/A28012000g离心10分钟除去。DNA的定量：取一份溶于8mM NaOH的DNA加水测A260值。一单位A260值相当于50g/ml双链DNA。根据DNA产量可估
9、计细胞数，人，大鼠，小鼠1106二倍体细胞含DNA的量分别为7.1g , 6.5g , 5.8g 。 预期产量：1mg组织或1106细胞提取DNA分别为肝和肾3-4g 骨骼肌，脑组织，胎盘2-3g 人，大鼠，小鼠培养细胞（1106）5-7g 成纤维细胞5-7g 应用：1.用于PCR 溶于8mM NaOH的DNA用0.1M HEPES调pH至8.4,取0.1-1g DNA用作模板。 2.酶切反应 用HEPES或1mM EDTA调节pH至适当值。每g DNA使用3-5单位的酶，80-90%的DNA是可消化的。 1ml 8mM NaOH溶解的DNA样品pH值调节 Final pH 0.1M HEPE
10、S(l) Final pH 1M HEPES(l) 8.4 86 7.2 23 8.2 93 7.0 32 8.0 101 7.8 117 7.5 159 注意事项： 1. DNA在中间层和有机相中时可在2-8保存过夜。 2DNA沉淀在75%乙醇中2-8可保存几个月。 3DNA在8mM NaOH溶液中4可放置过夜，如长期保存需用HEPES调节pH至7-8并且加EDTA至1mM，可置于4或-20长期保存。 常见问题分析： 得率低：A.样品匀浆和裂解的不彻底 B最终得到的DNA沉淀没有完全溶解 A260/A2801.70 ：A. 检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中 B酚除去的不彻底
11、，可用0.1M柠檬酸钠（含10%乙醇）再洗一遍DNA沉淀。 DNA降解：A.组织取出后没有马上处理或冷冻 B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70,而保存在了-5至-20 C样品匀浆时使用了高速匀浆仪 RNA污染：A.氯仿分层后水相去除的不干净 BDNA沉淀用0.1M柠檬酸钠（含10%乙醇）洗的不彻底 蛋白质的提取 准备试剂：异丙醇 含0.3M盐酸胍的95%乙醇 无水乙醇 1%SDS 操作步骤： 1.取沉淀DNA后剩余的上清，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1ml TRIzol加1.5ml异丙醇，室温放置10分钟，2-812000g离心10分钟弃上清。 2用含0.3M盐酸胍的95%乙醇洗涤蛋白
12、质沉淀。每使用1ml TRIzol加2ml洗涤液，室温放置20分钟，2-87500g离心5分钟，弃上清，重复两次。用2ml无水乙醇同样方法再洗一次。 3真空抽干蛋白质沉淀5-10分钟，用1%SDS溶解蛋白质，反复吸打，50温浴使其完全溶解，不溶物2-810000g离心10分钟除去。分离得到的蛋白质样品可用于Western Blot或-5至-20保存备用。 注意事项： 1.蛋白质沉淀可保存在含0.3M盐酸胍的95%乙醇或无水乙醇中2-8一个月以上或-5至-20一年以上。 2用0.1% SDS在2-8透析三次，10000g离心10分钟取上清即可用于Western Blot。 常见问题分析： 得率低：A.样品裂解或匀浆处理不彻底 B最后得到的蛋白质沉淀未完全溶解 蛋白质降解：组织取出后没有马上处理或冷冻 电泳时条带变形：蛋白质沉淀洗涤不充
