1、基金项目国家自然科学基金青年项目(82003323);大坪医院军事医学前沿创新项目(2019CXJSC014)作者单位陆军军医大学大坪医院(陆军特色医学中心)皮肤科，重庆 400042通信作者雷霞，E-mail:网络首发时间 2022-12-0609 22 网络首发地址https:/ 年 3 月第 37 卷第 3 期Mar.2023，Vol37，No3273http:/IL-1 通过调节 Stathmin/FAK 通路促进人真皮成纤维细胞迁移的作用及机制何咏磬，李凌霏，岑蕊言，邓雨萌，杨桂红，雷霞 摘要 目的探讨 Stathmin 在白细胞介素-1(IL-1)调节人真皮成纤维细胞迁移中的作用及
2、机制。方法使用 IL-1(10 ng/mL)处理细胞 24 h 模拟体外早期炎症反应，利用小干扰 NA 干预 Stathmin 和 FAK 表达，通过细胞划痕试验观察细胞迁移，Western blot 检测 FAK 和 Stathmin 蛋白表达情况。结果与对照组相比，IL-1处理组细胞迁移明显增加，Stathmin 和 FAK 蛋白表达明显增加;当下调 Stathmin或 FAK 表达后，细胞迁移明显受抑;并且，下调 Stathmin 表达后，FAK 蛋白表达明显降低。结论IL-1 可能通过调节 Stathmin/FAK 通路促进炎症早期人真皮成纤维细胞迁移。关键词 IL-1;Stathmi
3、n;FAK;成纤维细胞;迁移 中图分类号 751;392.2 文献标志码 A 文章编号 1001 7089(2023)03 0273 06 DOI 10 13735/j cjdv1001-7089 202207003The ole and Mechanism of IL-1 in Promoting Human Dermal Fibroblast Migration byegulating Stathmin/FAK PathwayHE Yongqing，LI Lingfei，CEN uiyan，DENG Yumeng，YANG Guihong，LEI Xia(Department of Der
4、matology，Daping Hospital，Army Military Medical University，Army SpecialtyMedical Center，Chongqing 400042，China)Corresponding author LEI Xia，E-mail: Abstract ObjectiveTo investigate the role and mechanism of interleukin-1(IL-1)in theregulation of human dermal fibroblast migration by Stathmin MethodsCe
5、lls weretreated with IL-1(10 ng/mL)for 24 h to mimic the early inflammatory response invitro，and small interfering NA was used to interfere with Stathmin and FAKexpression.Cell migration was observed by cell scratch assay，and FAK and Stathminprotein expression was detected by Western blot esultsComp
6、ared with the controlgroup，cell migration was significantly increased in the IL-1-treatment group，andStathmin and FAK protein expression were significantly increased.When Stathmin orFAK expression was down-regulated，cell migration was significantly inhibited;whenStathmin expression was down-regulate
7、d，FAK protein expression was significantlydecreased ConclusionIL-1 may promote human dermal fibroblast migration inearly inflammation by regulating the Stathmin/FAK pathway.Key words IL-1;Stathmin;FAK;Fibroblast;Migrationhttp:/成纤维细胞(fibroblast)是一类具有收缩功能的肌纤维母细胞表型的细胞，当皮肤创面形成后，炎症启动并加速成纤维细胞迁移，从而促进创面愈合1-
8、2，但具体机制仍不十分清楚。Stathmin 是一种微管解聚蛋白，参与微管动力学的调节。本课题组前期研究3 发现，其表达水平与皮肤成纤维细胞增殖和迁移密切相关，提示 Stathmin 在调控皮肤创面愈合中具有重要作用，但其机制远未阐明。黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)是一种非受体酪氨酸激酶，在参与调节细胞迁移和增殖等过程中起关键作用4，既往研究5-6 表明，炎症可以促进 FAK活化并促进细胞增殖和迁移。但 FAK 是否参与调节炎症状态下皮肤成纤维细胞迁移以及该过程是否与 Stathmin 有关均不清楚。因此，本研究拟阐明IL-1 通过调节 Stathmin/FA
9、K 通路介导人真皮成纤维细胞迁移的作用和初步机制。1材料和方法1.1材料人真皮成纤维细胞(human dermal fi-broblast，HDF)购自美国 ATCC 公司;DMEM 高糖培养基、胎牛血清(FBS)购自上海 VivaCell 公司;PBS缓冲液干粉购自索莱宝(Solarbio)公司;链霉素-青霉素双抗、0.25%胰酶(含 EDTA)、BCA 蛋白测定试剂盒、电转液购自碧云天公司;细胞裂解液购自北京鼎国公司;人 IL-1 重组蛋白购自 Sino Biological公司;FAK、Stathmin 抗 体购自 Proteintech 公司;GAPDH、Anti-rabbit IgG
10、 HP-linked 抗体购自 CellSignaling Technology(CST)公司;SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒、TBST 购自上海生工公司;电泳缓冲液粉剂购自塞维尔公司;PVDF 膜购自美国 Millipore 公司;ECL 超敏发光液购自硕华公司;小干扰 NA 购自吉玛基因公司。1.2方法1.2.1细胞培养和模拟体外炎症配制加入双抗和 10%胎牛血清的 DMEM 高糖培养基用于培养人真皮成纤维细胞。放入 37、5%CO2含量的培养箱中培养 2 d，待细胞融合至 80%左右进行细胞传代，选择对数生长期的细胞用于后续实验。利用不同浓度的 IL-1 体外刺激细胞，筛选适合的浓度(
11、10 ng/mL)用于后续实验。实验重复 3 次。1.2.2细胞划痕实验IL-1 重组蛋白 10 ng/mL处理细胞 24 h，小干扰 NA 进行细胞转染。待细胞在 3.5 cm 的培养皿中融合至 80%左右，使用 1 mL枪头在培养皿中进行划痕，然后用 PBS 缓冲液清洗3 遍轻柔冲掉细胞碎片。采用倒置光学显微镜(IX73，Olympus)拍照记录。使用创面愈合率反映细胞迁移，创面愈合率=(划痕面积0 h 划痕面积24 h)/划痕面积0 h，应用 Image J 软件对其进行分析。实验重复 3 次。1.2.3Western blot 检测人真皮成纤维细胞培养至对数生长期，IL-1 重组蛋白
12、10 ng/mL 处理细胞24 h，小干扰 NA 进行细胞转染。用IPA 裂解液在冰上裂解处理好的细胞，在 4 条件下以 21 400 g离心 15 min，吸取上清液。使用 BCA 蛋白测定试剂盒进行蛋白定量分析。蛋白样品通过 8%12.5%SDS-PAGE 加载和分离，然后将蛋白转移至 PVDF膜上。转膜完毕后封闭 1 h，将膜与特异性一抗(FAK、Stathmin、GAPDH)在 4 条件下孵育过夜。TBST 清洗 3 遍，室温下二抗孵育 1 h，TBST 再洗 3遍，最后使用 ChemiDoc XS 系统(ChemiDoc，Bio-ad Laboratories)曝光显影，用 Imag
13、e J 软件对各蛋白条带的灰度值进行分析。实验重复 3 次。1.2.4小干扰 NA 转染用 Stathmin 小干扰 NA(siSTMN)和 FAK 小干扰 NA(siFAK)转染细胞(siNC 作为对照)，按照说明书进行操作。siNC、siSTMN 或 siFAK 分别转染细胞 24 h，然后 IL-1(10 ng/mL)处理 24 h，进行检测。1.3统计学处理使用 GraphPad Prism 8 进行统计分析。结果用 x s 表示，两组间比较采用独立样本 t 检验分析，多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用 Tukeys 检验。当 P 0.05 时认为差异有统计学意义。2结果2.1
14、IL-1 对人真皮成纤维细胞迁移的影响当加入 IL-1(10 ng/mL)处理细胞 24 h 后，细胞迁移较对照组明显增加(t=3.868，P 0.05)，而加入IL-1(500 ng/mL)处理细胞 24 h 后，细胞迁移较对照组明显抑制(t=7.329，P 0.05)，见图 1。2.2Stathmin 蛋白表达在 IL-1 调节人真皮成纤维细胞迁移中的作用Western blot 检测人真皮成纤维细胞 Stathmin 蛋白表达情况(图 2)，结果显示:IL-1(10 ng/mL)处理细胞24 h 后，Stathmin 蛋白表达较对照组明显增加(t=7.131，P 0.05)。细胞划痕实验
15、观察细胞迁移(图 3)，结果显示:IL-1(10 ng/mL)处理细胞 24 h 后，人真皮成纤维细胞迁移较对照组明显增加(t=8.537，P 0.05)，当使用 siSTMN 干扰 Stathmin 表达后，siSTMN 组和IL-1+siSTMN 组细胞迁移均明显减弱(t=5.086、7.240，P 0.05)。472中国皮肤性病学杂志 2023 年 3 月第 37 卷第 3 期Chin J Derm Venereol，Mar.2023，Vol.37，No.3何咏磬，李凌霏，岑蕊言，等 IL-1 通过调节 Stathmin/FAK 通路促进人真皮成纤维细胞迁移的作用及机制http:/Not
16、e:*P 0.05，P 0.01.The migration of human dermal fibroblasts before and after treatment with IL-1(10 ng/mL)、IL-1(500 ng/mL)was observed bycell scratch assay;Quantitative analysis of scratch assay图 1IL-1 处理前后对人真皮成纤维细胞迁移的影响Fig.1Effects of IL-1 on migration of human dermal fibroblastsNote:P 0.01.The expression of Stathmin protein in human dermal fibro-blasts before and after IL-1(10 ng/mL)treatment was detectedby Western blot;Quantitative analysis of Western blot图 2IL-1 处理前后对人真皮成纤维细胞 Stathmin 蛋白表达的影响
