1、安徽科技学院学报，（）：收稿日期：基金项目：安徽科技学院乡村振兴专项（）；安徽科技学院发展基金（）；安徽省高校协同创新项目（）。作者简介：邓亚飞（），男，安徽阜阳人，硕士研究生，主要从事羊致病菌地区流行特性与病原分子学特性研究。通信作者：路振香，教授，：。株山羊节杆菌的分离鉴定、药敏试验及耐药基因检测邓亚飞，郭伟娜，刘畅，贺绍君，路振香，（安徽科技学院 动物科学学院，安徽 凤阳 ；动物营养调控与健康安徽省重点实验室，安徽 凤阳 ）摘要：目的：对送检的局部皮下出现包块的病山羊进行病原菌的分离鉴定，并对该致病菌的耐药情况及机制进行初步研究。方法：采集病山羊皮下包块内的组织液进行病原菌分离培养、革兰
2、染色、镜检、生化试验和药物敏感试验以及分子水平鉴定，并检测耐药基因。结果：成功分离到株革兰阳性、排列不规则的球菌，同源性分析显示为节杆菌。该菌对克林霉素、头孢噻吩、氧氟沙星等不敏感；对链霉素、麦迪霉素、头孢曲松中度敏感；对红霉素、青霉素、头孢呋辛等敏感。该菌含有磺胺类耐药基因 与卡那霉素耐药基因 。结论：该分离菌具有较强的耐药性，携带有耐药基因 与 。关键词：节杆菌；分离鉴定；药敏试验；耐药基因；山羊中图分类号：文献标志码：文章编号：（）开放科学（资源服务）标识码（）：，（，；，）：，：，：，：；节杆菌（）为放线菌纲，放线菌亚纲，放线菌目，微球菌亚目，微球菌科。该菌革兰阳性，需氧，生长过程中有
3、明显的杆状和球状周期变化。节杆菌对多种有机物有降解作用，被认为是主要的有机物分解者。该菌可在营养缺乏、温度剧变、辐射、氧自由基和有毒物等环境中长期存活，对部分重金属和铬酸盐等有毒物质有很强的耐受性。该菌是土壤中最常分离出的菌种之一，目前有感染导致人慢性皮肤病变及节杆菌菌血症等相关记录。近年来，从人体标本中分离到种节杆菌为条件致病菌，分别为卡氏节杆菌、沃氏节杆菌、解肌酐节杆菌、氧化节杆菌、黄色节杆菌和白色节杆菌。节杆菌分布广泛，受环境抗生素特别是抗生素使用量大的场所影响较大，其耐药性研究对防治节杆菌引起的临床疾病有重要意义。本研究拟对安徽省滁州市某山羊养殖场送检的右侧肋腹部近尾端位置皮下出现 大
4、小的皮下脓肿的病山羊进行病原菌的分离培养、革兰染色、镜检、生化试验、药敏试验，并对其进行 序列扩增、同源性分析及耐药基因检测，为该病的实验室诊断、临床治疗及耐药情况提供参考。材料与方法 材料 样本材料安徽省滁州市某山羊养殖场只病山羊的皮下包块。主要试剂药敏纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司（生产批号：）；购自宝生物工程（大连）有限公司；引物由通用生物技术（安徽）有限公司合成。主要仪器 梯度 仪（东胜兴业科学仪器有限公司）；电泳仪（美国 公司）；凝胶系统成像仪（上海天能科技有限公司）。方法 病原菌的分离培养、纯化与革兰染色、镜检从山羊皮下包块处无菌穿刺，并用灭菌接种环蘸取此穿刺液分别于麦康凯琼脂
5、、普通营养琼脂培养基上划线，培养 ，挑取培养出的单个典型菌落进行纯化，革兰染色后镜检。分离菌的生化试验分离菌纯化后进行糖发酵试验、试验、试验及吲哚试验。分离菌的药敏试验用涂布棒刮取适量纯化后的分离菌均匀涂布在普通营养琼脂平板表面，将药敏纸片均匀地贴上，培养 ，观察并记录结果。分离菌 模板的制备用接种环取分离纯化后的典型菌落于 的超纯水中，混匀，水浴 后，冰浴 ，离心 ，取上清液，置于 下保存备用。分离菌的 扩增与序列测定参照细菌的通用引物设计一对引物，上游引物序列：，下游引物序列：。反应体系为：、上、下游引物各（），细菌 模板，超纯水。总体积为。反应条件为：预变性 ；变性；退火；延伸，共 个循
6、环，延伸 。扩增完成后，将所得 产物用琼脂凝胶电泳（、）进行检测。分离菌的耐药基因检测参照刘红玉 的方法合成本试验所需细菌耐药基因引物，引物序列如表所示。本次试验所扩增的耐药基因分别是编码内酰胺酶类耐药基因 ，磺胺类耐药基因 ，喹诺酮类耐药基因 ，头孢菌素类耐药基因 以及卡那霉素耐药基因 。反应体系为：，上、下游引物各（），细菌 模板，超纯水。总体积为。反应条件为 预变性 ；变性；退火；延伸，共第 卷第期邓亚飞，等：株山羊节杆菌的分离鉴定、药敏试验及耐药基因检测 个循环，延伸 。表耐药基因 扩增序列 耐药基因引物名称引物序列（）产物大小 结果与分析 致病菌分离培养及革兰染色、镜检结果从山羊皮下
7、包块组织液中分离到株革兰阳性、排列不规则的球菌，该菌在普通营养琼脂平板上呈淡黄色圆形、边缘整齐、表面光滑、湿润、轻度隆起、不透明的中等大小菌落。在麦康凯琼脂平板上为灰白色圆形、边缘整齐、表面光滑、湿润、轻度隆起、不透明的中等大小菌落。在兔血琼脂平板上为灰白色圆形、边缘整齐、表面光滑、湿润、轻度隆起、不透明不溶血的中等大小菌落（图）。图细菌在几种培养基上的生长表现及革兰染色结果 注：为普通营养琼脂平板；为麦康凯琼脂平板；为兔血琼脂平板；为革兰染色结果（）。分离菌生化试验结果该菌不发酵葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖，试验、试验及吲哚形成试验结果均呈阴性。分离菌药敏试验结果药敏试验结果显示，该分离菌对克
8、林霉素、头孢噻吩、氧氟沙星、四环素、复方新诺明、氨曲南不敏感；对链霉素、麦迪霉素、头孢曲松中度敏感；对红霉素、青霉素、头孢呋辛、万古霉素、克拉霉素、苯唑西林、诺氟沙星敏感（表）。表分离菌药敏试验结果 药物抑菌圈直径药物抑菌圈直径红霉素 链霉素 氨曲南复方新诺明万古霉素 麦迪霉素 克林霉素头孢噻吩青霉素 头孢曲松 氧氟沙星克拉霉素 四环素诺氟沙星 头孢呋辛 苯唑西林 安徽科技学院学报 年 分离菌 序列扩增结果和分离菌进化树构建结果由图所示，该菌与 中的节杆菌 同源率达 。因此，该菌为节杆菌。图分离菌株 基因序列 产物凝胶电泳图 注：为 ，为分离菌。图分离菌 遗传进化树 注：为该分离菌。分离菌耐药
9、基因 扩增结果结果显示，、耐药基因检测结果为阴性，、扩增出预期大小片段（图）。图分离菌耐药基因凝胶电泳图 注：为 ，分别为 、。结论与讨论节杆菌多数为非致病性的菌株，研究者多从节杆菌分解环境中有毒害物质、有机物等方向展开研究，而对其致病特性研究却较少。考虑到节杆菌种群在生态环境中分布广泛、适应性强以及营养多功能性等优势地位，其致病情况和致病机理也应当予以重视。分布广泛即意味着其接触到抗生素的群体大且接触抗生素种类多，因此其耐药情况以及机制也应当及时受到关注，从而保证一旦发病，能够及时有效得到治疗和控制。本试验从患病山羊的皮下包块组织液中分离得到株排列不规则的革兰阳性球菌，从细菌形态、培养特性来
10、看，该分离菌与金黄色葡萄球菌极其相似，金黄色葡萄球菌也是常见的导致外伤感染的细菌，初步判定为金黄色葡萄球菌感染所致。但对该分离菌同源性比对结果显示，该菌与 中登录号为 的节杆菌同源性达 ，因此，鉴定该菌为节杆菌。与提交自河北保定的 、山东泰安的 、湖北武汉的 、江苏南京的 以及新德里的 等菌株亲缘关系较低，这也与地域性的分布差异存在一定联系。药敏试验结果显示，红霉素、青霉素、克拉霉素、苯唑西林、诺氟沙星、万古霉素等药物对分离菌有较好第 卷第期邓亚飞，等：株山羊节杆菌的分离鉴定、药敏试验及耐药基因检测的抑制效果，而氨曲南、复方新诺明、克林霉素、头孢噻吩等药物对分离菌没有效果。耐药基因扩增结果显示
11、，该菌含有磺胺类耐药基因 与卡那霉素耐药基因 。本实验中未检测出头孢菌素类耐药基因 ，因此对头孢菌素类药物的耐药机理仍需进一步深入研究。后对病山羊患处进行包块组织液引流和消毒处理，同时肌肉注射青霉素进行治疗。该羊的羊圈围栏采用金属材质，棱角清晰且存在多处尖锐部位，山羊性情活泼好动，皮肤很容易被围栏上的锐物划伤，环境中的节杆菌通过伤口进入皮肤造成感染。由于羊毛遮挡畜主不能及时发现伤口做消毒处理，从而使得节杆菌在其中大量繁殖，形成肉眼可见的肿胀包块。此类感染大多与外伤密切相关，因此，对于舍饲山羊，围栏需要表面光滑，避免有尖锐物出现；对于放牧羊群，避免在有荆棘等易造成划伤的地方放牧，从而避免或者减少
12、该病的发生。从药敏试验和耐药基因 扩增结果可知，该株节杆菌对一些抗生素不敏感。集约化养殖模式下，一些养殖者不具备相关的知识和条件，当疾病发生时，往往会大剂量不规范地使用抗生素，这会很快导致耐药菌株产生。因此，如何规范使用抗生素，使用什么样的抗生素，以及如何延缓耐药菌的出现都是值得兽医工作者重视的问题。综上，本次出现局部皮下包块为特征的山羊是皮肤出现外伤后感染节杆菌所导致的，且此株节杆菌表现出较强的耐药性，具有多种耐药基因。参考文献：李娟，冷艳，等节杆菌属细菌处理有机物和重金属污染物的研究进展环境科学与技术，（）：，（）：，（）：陈志，邹情雅，潘晓鸿，等铅锌矿尾矿坝分离节杆菌 对 的耐受和吸附性能研究农业生物技术学报，（）：金羽，曲娟娟，李影，等一株耐铅细菌的分离鉴定及其吸附特性研究环境科学学报，（）：，（）：，（）：，（）：，（），（）：尤敏，管福来，赵乃昕，等一种条件致病节杆菌的分离与鉴定潍坊医学院学报，（）：，（）：，（）：王静，孙艳，杨海麟，等 节杆菌 黄嘌呤氧化酶的诱导效应研究 生物技术，（）：姚火春兽医微生物学实验指导 版北京：中国农业出版社，刘红玉青岛地区禽源.毒力因子和耐药性调查与分析哈尔滨：东北农业大学，（责任编辑：姜锦鹏）安徽科技学院学报 年
