1、GB/T17999.2-2008SPF鸡微生物学监测第2部分:SPF鸡红细胞凝集抑制试验1范围GB/T17999的本部分规定了红细胞凝集抑制试验的技术要求。本部分适用于对SPF鸡进行以下病原微生物的血凝抑制抗体检测:禽流感病毒(Avian InfluenzaVirus),传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus),新城疫病毒(Newcastle Disease Virus),禽腺病毒群(减蛋综合征病毒)(Avian Adenovirus Group),鸡毒支原体(Mycoplasma galliseptic-um),滑液粪支原体(Aycoplasma syno
2、viae)。2原理许多病原微生物具有凝集动物红细胞的能力,这种凝集红细胞的能力能被特异性抗体所抑制,因此可用已知病原微生物检测相应的血凝抑制性抗体。3试剂和器材3.1试剂3.1.1血凝抗原。3.1.2阴性、阳性血清。3.1.3被检血清。3.1.4鸡红细胞。3.1.50.85%氯化钠(NaC)(见附录A)。3.1.6阿氏液(见附录A)。3.2器材3.2.196孔微量血凝板(U形孔或V形孔)。3.2.2微量移液器(量程为25L、50L、100L)或可调微量移液器(量程涵盖25L、50L、100L)及吸头。3.2.3水浴锅。3.2.4离心机与刻度离心管。4操作程序4.1红细胞悬液的制备和抗原血凝效价
3、测定4.1.11%鸡红细胞悬液的制备参见附录B。4.1.2抗原血凝效价测定4.1.2.1于96孔微量血凝板的第1孔第12孔加入生理盐水25L,共作2排。每排的第1孔加入抗原25L,用微量移液器,从第1孔第11孔对抗原作系列倍比稀释:即将第1孔的抗原与生理盐水用移液器反复吹吸3次后,吸出25L移至第2孔,再反复吹吸3次后,吸出25L移至第3孔,依此类推,直至第11孔。从第11孔中吸出25L弃去,此孔抗原的最终稀释度为1:2(即111og)。第12孔作为对照孔,GB/T17999.2-20084.1.2.2每孔中加入25L生理盐水,再加入1%鸡红细胞悬液25L。4.1.2.3将血凝板置振荡器上50
4、0r/min振荡1min2min。4.1.2.4在室温1825C下静置20min40min,或37C静置15min20min,或4C静置60 min.4.1.2.5抗原血凝效价判定:在反应时间内,对照孔的红细胞全部沉淀时,观察判读血凝结果。对于使用U形孔微量血凝板进行的试验,可根据表1中列举的标准进行判读。表1血凝试验结果判读标准类别孔底所见结果1红细胞全部凝集,均匀铺于孔底,即100%红细胞凝集+2红细胞凝集基本同类别1,但孔底有大图+3红细胞于孔底形成中等大的图,四周有小凝块+7红细胞于孔底形成小圆点,四周有少许凝集块分红细胞于孔底呈小圆点,边缘光滑整齐,即红细胞完全不凝集注:能使红细胞完
5、全凝集(100%凝集,十十十十)的抗原最高稀释度为该抗原的血凝效价,此效价为1个血凝单位,注意对照孔应呈现完全不凝集(一),否则此次试脸无效,对于使用V形孔微量血凝板进行的试验,将血凝板倾斜70,观察沉淀于孔底的红细胞是否沿倾斜面向下呈线状流动。以出现全部凝集(红细胞无流动)的抗原最大稀释度为该抗原的血凝效价,该效价为1个血凝单位。若血凝效价高于111o时,可继续增加稀释孔数,进行血凝效价测定。血凝试验举例说明见表2,表2微量血凝试验操作、结果判定举例孔号23456789101112滴度(Iog:)167891011对照生理盐水/L252512512512525252525252525倍比稀释
6、的抗原/2525252525252525252525弃去254L生理盐水/L2525252525252525252525251%鸡红细胞/L25252525625252525252525作用温度、时间1825,静置2040min判定举例+血凝价判定为91og。4.2血清的处理和血凝抑制试验4.2.1被检血清样品准备被检血清,包括阳性、阴性血清,置于56C水浴中30min45min,以破坏补体及血凝抑制因子。4.2.2抗原准备进行血凝抑制试验时各种抗原所用血凝单位为4个血凝单位。以4个血凝单位抗原的配制为例:如果某抗原的血凝效价为91og,配制4个血凝单位则进行1:2稀释(2”/22=2),取生
7、理盐水11.8mL,加入1:10稀释的抗原1.0mL,混合均匀即可。4.2.3抗原血凝效价的重测定4.2.3.1为了确证血凝抑制试验时使用抗原的活性,有必要对已配制的4个血凝单位抗原进行血凝效2GB/T17999.2-2008价的再测定,此项试验常与血凝抑制试验同时进行。4.2.3.2第1孔分别加入50L4个血凝单位抗原。4.2.3.3第2孔第4孔各加生理盐水25L。4.2.3.4将抗原分别作系列倍比稀释至第4孔,从第4孔吸25L弃去。4.2.3.5每孔加1%鸡红细胞悬液25L。4.2.3.6将血凝板置微量振荡器上以500r/min振荡1min2min,4.2.3.7室温1822感作20min
8、40min左右。4.2.3.8观察结果,4、2、1血凝单位孔红细胞出现完全凝集,0.5血凝单位孔红细胞出现50%凝集。若不相符,则应重新标定抗原的血凝单位,同时进行的血凝抑制试验也需重新进行。4.2.4血凝抑制试验4.2.4.1血凝板每排检测一份被检血清,设阳性血清与阴性血清对照。4.2.4.2第1孔第12孔,每孔加人25L生理盐水。4.2.4.3吸取血清25L加入第1孔中,混匀后吸取25L加入第2孔中,依此类推倍比稀释到第11孔,弃去25L,第12孔作为空白对照孔。4.2.4.4第1孔第11孔分别加入25L4个血凝单位抗原。血凝板置微量振荡器上以500r/min振荡1min2min,4.2.
9、4.5每孔加入1%鸡红细胞悬液25L,以500r/min振荡1min2min混匀,置室温(1822C)静置20min40min或4C静置60min,此时对照孔(第12孔)的红细胞已沉淀为一个圆点。4.2.4,6静置完毕,对于使用U形孔微量血凝板进行的试验,根据表1中列举的标准进行判读。对于使用V形微量血凝板进行的试验,将血凝板倾斜T0,凡沉淀于孔底的红细胞沿倾斜面向下呈线状流动。呈现与红细胞对照孔(第12孔)一样者为完全不凝集孔。出现完全不凝集的血清最高稀释度为该被检血清血凝抑制效价。血凝抑制试验举例说明见表3。表3微量血凝抑制试验操作、结果判定举例孔号o滴度(1og)1011对照生理盐水/L
10、252525252525252525252525倍比稀释的被检血清/L2525252525252525252525弃去25 uL4个血凝单位抗原/L25252525252525252525作用温度,时间1825,静置2040min1%鸡红细胞/L25262525252525252525作用温度,时间18一25,静置20-40min判定举例+被检血清血凝抑制价为1:32(2)。5结果判定5.1检查各种对照。阴性血清血凝抑制滴度应1:4(22),阳性血清血凝抑制滴度与已知滴度不应相差一个滴度以上。红细胞对照无血凝现象。5.2禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、禽腺病毒群(EDS)的血清血凝抑制效价1:16(2)判为阳性;鸡毒支原体、滑液囊支原体的血清血凝抑制效价1:64(2)判为阳性。