1、SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T 1 1 4 5 一 20 0 2 植 物 检 疫首蓓黄萎病菌检疫鉴定方法P l a n t q u a r a n t i n e-Me t h o d s f o r i n s p e c t io n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f a l f a l f a w i l t(V e r t i c i l l i u m a l b o-a t r u m R e i n k e&B e r t h o l d)2 0 0 2 一 1 1 一 2 5 发布2 00 3 一 0 5 一 01实
2、施中华人民共和国国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局发 布S N/T 1 1 4 5-2 0 0 2前言 本标准在制定过程中，经过调查研究、分析有关资料，根据首楷黄萎病菌的生物学特性、病理学原理确定各项技术指标。本标准给出了首蓓黄萎病菌的症状特征、病原菌形态学特征以及致病性测定，三者需结合起来作为鉴定依据。本标准的附录 A、附录B为资料性附录.本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国深圳出人境检验检疫局.本标准主要起草人:章桂明、王颖、王伍、黄佩卿、程颖慧。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。S N/T 1 1 4 5-2 0 0 2 植 物 检
3、疫首蓓黄萎病菌检疫鉴定方法范围 本标准规定了植物检疫中首猎黄萎病菌的检疫和鉴定方法。本标准适用于首f ft，包括首箱种子、首楷种苗以及首糟黄萎病菌其他寄主中首楷黄萎病菌的检疫和鉴定方法。术语和定义下列术语和定义适用于本标准。轮状 分生 抱子梗 v e r t i c i l l a t e c o n i d ia p h o r a 轮枝菌的分生抱子梗类型，在直立的分生抱子梗每节基部膨大处轮生若干个小梗，可以有 1 轮5轮。2.2 厚垣抱子 c h l a m y d o s p o r e 由菌丝个别细胞膨大形成，具有厚壁和浓缩的原生质，可抵抗高温、低温、干旱、营养短缺等不良的环境条件的一
4、种休眠抱子。2.3 微菌核 m ic r o s c l e ro t i u m 暗褐色或黑色近球形坚硬的休眠体，是单一菌丝体不断芽殖聚集而来。2.4 休眠菌丝体 r e s t i n g m y c e l i u m 休眠体，呈暗褐色或黑色，分隔规则，隔膜间膨大，呈念珠状。原理 首楷黄 萎病菌(V e r t i c i l l i u m a l b o-a t r u m r e i n k e&b e r t h o l d)是首楷上的一种危险性有害生物。首稽黄萎病菌 属真菌界(F u n g i)，半知菌亚门(D e u t e r o m y c o t i n a)，丝抱纲
5、(H y p h o m y c e t e s)，丝抱目(H y-p h o m y c e t a l e s),丛梗抱料(Mo n i l i a c e a e)，轮枝抱属(V e r t i c i l l i u m)。该病菌的为害症状、形态学特征与其他病原菌(包括其他轮枝菌)不同，是鉴定该病菌的依据。仪器设备4.1 仪器4.1.1 实体显微镜4.1.2 生物显微 镜4.1.3 电子分析天平(感量 1 八 0 0 0 0)4.1.4 普通天平(感量 1 八0 0)S NI T 1 1 4 5-2 0 0 24.1.5 超净工作台4.1.6 生化培养箱4.1.7 光照培养箱4.1.8
6、 高压灭菌锅4.2 实验用典4.2.1 培养皿、塑料培养皿(9 c m)4.2.2三角瓶(2 5 0 mL)4.2.3 试管(1 2 m m)4.2.4 烧杯(1 0 0 mL,1 0 0 0 mL)4.2.5 手术刀4.2.6 手术剪4.2.7 镊子4.2.8 载玻片(2 5.3 mm X7 6.2 m m)4.2.9 盖玻片(1 8 mm X 1 8 m m)4.2.1 0 量筒(5 0 0 mL)4.2.1 1 吸管4.2,1 2 酒精灯4.2、3 滤纸4.2.1 4 p H计4.2.1 5 塑料袋药品梅干煎汁酵母浸膏乳糖葡萄糖琼脂取样与现场检查 气.，一，月5 .已J二JJ口找八06.
7、1 首蓓种子的取样 按以下要求随机取样带回实验室检验:1.5 k g-1 0 k g 取 1 份;1 1 k g-1 0 0 k g 取2 份;1 0 1 k g-5 0 0 k g 取3 份;5 0 1 k g-1 0 0 0 k g 取4 份。每份样品的重量为 1.5 k g,1.5 k g 以下全部取样。6.2 首荷种苗、植株的取样 按以下标准随机取样:5 0 株以 下取1 份;5 1 株一2 0。株取2 份;2 0 1 株 1 0 0 0 株取3 份;1 0 0 1 株一5 0 0 0 株取4 份;5 0 0 1株以上每增加 5 0 0 0株增取 1 份，不足5 0 0 0 株的余量计
8、取 1 份样品海 份样品5 株。6.3 现场检查 首稽种子取样时往意检查种子中有无可疑带病种子、首稽残体;植株取样时注意检查有无可疑病株。若有可疑病株应将其挑出来，并送实验室做进一步检验鉴定。制样按6.1 的要求 抽取的 每份样品 应充分混匀，制成平 均样品，从每份 平均样品中 取2 5 g 作为 检验样品。S N/T 1 1 4 5-2 0 0 28实脸 室检验B.1 种子检验8.1.1 吸水纸培养8.1.1.1 吸水纸培养皿的准备 用。.2%的 2,4-D钠盐溶液浸演无菌吸水纸，然后将吸水纸(滤纸)铺在直径为 9 c m的已灭菌的培养皿底部。每皿铺 3层。8.1.1.2 样品种子的放it
9、将抽取的检验样品不经表面消毒直接放里于培养皿中，每皿均匀放置2 5 粒种子。8.1.1.3 培养 将培养皿置于 2 1 C-2 3 条件下培养，每昼夜用黑光灯照明1 2 h，培养 1 0 d,8.1.1.4 镜检 1 0d后取出培养皿，用体视显微镜逐粒检查种子，根据菌落特征，主要是轮枝状分生抱子梗和分生抱子着生的整体形象，检查出带菌种子。B.1.2 选择性培养 从带菌种子上挑取抱子接种到梅干煎汁酵母琼脂培养基(P L Y A)(参见附录B.1)中，在2 4 C-2 6 条件下作进一步培养，2 0 d后检查培养结果。8.1.3 致病性测定8.1.3.1 接种方法 采用浸根法接种，从培养两周的病菌
10、培养基上刮下分生抱子配制成 1 0 个抱子/ml的悬浮液，取在无病条件下栽培 4 周龄长出3片4片真叶的高感营楷品种幼苗，清洗掉根部土壤并用刀片切去主根根尖 1 c m-2 c m后立即在抱子悬浮液中浸根 5 m i n,然后栽人营养钵中，在2 2 C 2 5 和每天光照1 4 h-1 5 h 下培育。8.1.3.2 症状检查 接种 1 周后，植株开始表现症状，进行症状检查。8.1.3.3 病原菌再分离及鉴定 取小块病健交接 处组织 用2%-3%次氛酸钠溶液消毒3 m i n，用无菌水冲洗3 次.置于P D A 培养基(见附录B.2)上 2 2 C 2 4 进行分离培养，7 d后观察菌落性状和
11、病原菌特征.8.2 种苗、植株的检验8.2.1 症状检查 用肉眼查看种苗、植株样品，根据首箱黄萎病的症状挑选出怀疑发病的植株，带人实验室做进一步检验。B-2.2 保湿培养 取待检 样品的茎 或叶柄切 成1 c m长的 小段，用自 来水冲洗掉表面的泥土杂物后，用含2%-3 0 a 次抓酸钠溶液消毒 1 min-2 mi n，无菌水冲洗 3 次后，用灭茵解剖刀横切成1 m m-4 m m的小片，并放置在湿皿内滤 纸上，每皿5 片一1 0 片，湿 皿封闭在塑 料袋中2 2 下培养。8.2.3镜检 用实体显微镜观 察有无产生病原菌子实体，观察分生抱子梗的基部颜色，以 及在吸 水纸与皿底玻璃之间是否形成
12、休眠结构。8.2.4 分离培养和致病性测定 没有检测到子实体的，按照 8.1.3.3 和 8.1.3 所述步骤，进行菌分离培养和致病性测定。S N/T 1 1 4 5-2 0 0 29 鉴定标准9.1 接种苗症状 接种7 d 后，植株开始发病，中叶自 下而上变黄和萎蔫。下部小叶多呈斑块状黄色，上部黄化中 叶叶脉仍可保持绿色，严重时叶片枯死脱落。重病植株矮化.茎杆细弱，倒伏，整株枯萎死亡。9.2 病原菌形态特征9.2.1 P D A上的培养性状 病原菌在P D A培养基上生长很快，最初形成的菌落无色，2 周3 周后因产生了 休眠菌丝而 变成灰揭色至黑褐色;不芽殖形成类似 微菌核状的结构，不产生
13、厚垣抱子和微菌核;产生的 分生抱子梗多，直立，无色，分生抱子梗基部暗色、膨大，或无色、无明显膨大.上生有 1 层一5 层瓶状小梗，每层的瓶体小梗数1 个一5 个一可轮生、对生或互生，常见分生抱子梗二次分枝，瓶状小梗大小为(2 0 p m-3 0 r a m或5 0 tc m)X(1.4 p m-3.2 p m);分生抱子着生于瓶状小梗的端部，椭圆 形或回 桶形，透明，多 为单胞，少数有 一 个 隔，大 jl为(3.5 p m-1 0.5 1,m或1 2.5 p m)X(2 p m-4 K m);病 菌 生 长 退 度 为2 0 C-2 3 C(见 附录 A),9.2.2 P L Y A上的培养
14、性状 病原菌在 P L Y A上培养时，在 2 4 C-2 6 条件下，菌落呈辐射状扩展，培养 2 0 d可产生休眠菌丝体.93 首有黄葵病菌与其近似种的形态学区别 首蓓黄萎病的近似种主要有大丽轮枝菌(V.d a h l i a e),V.n i g r e s c e n s,V.n u b i l u m、v.V.t r i c o r p u:等，曹落黄萎病菌与其近似种形态学的主要区别为:首稽黄萎病菌产生黑色的休眠菌丝，不产生微菌核和厚垣抱子。休眠菌丝多抱、隔膜间隔膨 大，呈节 结状，菌丝直径为2.8 p m -6.7 K m;-V.d a h l i a。产生黑色微菌核，葡萄状或念珠状
15、，由多数球形的膨大细胞构成，微菌核直径为 (1 5 ra m-1 7 8 p m)X(1 8.9 A m-5 8 K m);-V.n i g r e s c e n，产生黑褐色厚垣抱子，球形、近球形，大多单生、少数间生，直径为5.3 A m -8.1 r m;V.n u b i l u m产生黑褐色厚垣抱子，单生或串生，直径为8.4 r a m-1 7.5 p m;-V.t r i c o r p。产生休眠菌丝、微菌核或厚垣抱子，休眠菌丝黑揭色，各细胞膨大，呈念珠 状，直 径为3.2 ra m-7.1 ra m。微菌 核在休眠菌丝上产生，由 膨大细胞构成，长形至近球形，直径为 3 4!1 m-
16、8 0 r x m,1 0 结果判定 如果分离物的形态特征与 9.2 描述的病原菌形态特征相吻合，通过致病性测定所获得的症状特征也与 9.1 所描述的症状相吻合，再分离获得的培养物的形态特征也仍与 9.2描述的病原菌形态特征相吻合，则可确定为首 糟黄 萎病菌(V e r t i c i l l i u m a l b o-a t r u m R e i n k e&B e r t h o l d),1 1 样品保存1 1-1 原始样品保存 现场抽取的种子样品应分别留一半，置于低温干燥、防虫防鼠处妥善保存2 个月。如发现首藉黄萎病菌，该样品至少许保存 6 个月。保存期满后，需经灭菌处理。1 1.2 菌种保存 分离到的首楷黄萎病菌菌种，转人P D A试管斜面培养基上。置于5 黑暗条件下保存至少1 2个月。S N/T 1 1 4 5-2 0 0 2 附录A 资料性附录)V.a l b o-a t r u m的形 态学特征圈三 i v，3 s s2.o%10 i对a 9to1 在马铃薯坏死茎上形成的暗色菌丝体;2(3)-暗色菌丝体的萌发;4 分生抱子梗及分生抱子;5 成熟的分生抱子;6-初期的
