1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 贝类中星状病毒检测方法普通犘 犆 犚和实时荧光犘 犆 犚方法犇 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犪 狊 狋 狉 狅 狏 犻 狉 狌 狊 犻 狀狊 犺 犲 犾 犾 犳 犻 狊 犺犆 狅 狀 狏 犲 狀 狋 犻 狅 狀 犪 犾犚 犜 犘 犆 犚犪 狀 犱狉 犲 犪 犾 狋 犻 犿 犲犚 犜 犘 犆 犚犿 犲 狋 犺 狅 犱 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准贝类中星状病毒检测方法普通犘 犆 犚和实时荧光犘 犆 犚方法 中 国 标 准 出 版 社 出 版北京复兴门外三
2、里河北街 号邮政编码：网址 电话：中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张 字数 千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号：定价 元书书书前言本标准的附录 为规范性附录，附录和附录为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、国家认监委认证认可技术研究所、国家质量监督检验检疫总局标准法规中心、北京金纳信生物科技有限公司。本标准的主要起草人：曾静、魏海燕、杨光、范爱红、饶红、江明、聂棱、张西萌。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。犛 犖犜 w w w.b z f x w.c o m贝类中星状病毒检测方法普通犘 犆 犚和实时
3、荧光犘 犆 犚方法范围本标准规定了贝类中星状病毒的普通 和实时荧光 检测方法。本标准适用于贝类中星状病毒的检测；食物中毒样品中星状病毒的检测可参照使用。规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。分析实验室用水规格和试验方法 实验室生物安全通用要求 基因检验实验室技术要求术语、定义和缩略语下列术语、定义和缩略语适用于本标准。术语和定义 星状病毒犪 狊 狋 狉 狅 狏 犻 狉
4、 狌 狊属于星状病毒科，星状病毒属。病毒颗粒呈球形，无包膜，直径为 。病毒基因组为单股正链 ，长 ，端有 尾。犆 狋值 犮 狔 犮 犾 犲 狋 犺 狉 犲 狊 犺 狅 犾 犱每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。纳米磁珠犿 犪 犵 狀 犲 狋 犻 犮狀 犪 狀 狅 狆 犪 狉 狋 犻 犮 犾 犲 狊利用纳米技术将磁性材料如 制成纳米微粒，大小介于原子簇与一般微粒子之间（直径一般小于 ），的量子尺寸效应使之展现出许多特有的性质，如比表面积大、表面活性中心多、表面反应活性高、吸附能力强等，为生物和医学应用研究提供了更加科学的手段。缩略语 犇 犈 犘 犆犱 犻 犲 狋 犺 狔 犾 狆
5、 狔 狉 狅 犮 犪 狉 犫 狅 狀 犪 狋 犲焦碳酸乙二酯。犕犖 犘犿 犪 犵 狀 犲 狋 犻 犮狀 犪 狀 狅 狆 犪 狉 狋 犻 犮 犾 犲 狊纳米磁珠。犛 犖犜 w w w.b z f x w.c o m 犘 犈 犌狆 狅 犾 狔 犲 狋 犺 狔 犾 犲 狀 犲犵 犾 狔 犮 狅 犾聚乙二醇。犚 犖 犪 狊 犲 狉 犻 犫 狅 狀 狌 犮 犾 犲 犪 狊 犲核糖核酸酶或 酶。犫 狆犫 犪 狊 犲狆 犪 犻 狉碱基对。方法原理在偏碱性甘氨酸缓冲液中通过物理研磨的方式对贝类消化组织进行均质，并通过温育促进病毒颗粒的释放，利用 沉降病毒。然后一方面可以采用 或其他等效裂解液提取总，并进一步使
6、用包被了 的磁珠与星状病毒 端的 特异结合，纯化病毒；另一方面也可采用纳米磁珠直接从 沉降后的病毒悬液中富集病毒粒子，吸附于纳米磁珠上的病毒粒子经高温裂解，释放出病毒 ，无需进一步纯化。上述两种提取病毒 的方法分别称为 法（）和纳米磁珠法。最后利用普通 和实时荧光 进行检测。试剂除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合 中一级水的要求。匀浆缓冲液：甘氨酸缓冲液（），见附录 。溶液：见附录 。裂解液：或其他等效产品。三氯甲烷。异丙醇。无 去离子水：见附录 。乙醇：见附录 。（）磁珠：?），包括 （）磁珠、吸附缓冲液（见附录 ）、漂洗缓冲液（见附录 ）以及 （）。病毒核酸纳米磁珠提取
7、试剂盒：包括纳米磁珠、结合缓冲液以及核酸释放液（北京金纳信生物科技有限公司，）。参见附录。逆转录试剂盒：（）或其他等效产品）。）给出这一信息是为了方便本标准使用者，并不表示只认可该产品。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用等效产品。荧光 混合液试剂盒：（）或其他等效产品）。相对分子质量标记：。犜 犪 狇酶：（或其他等效产品）。：各含 ，。缓冲液：见附录 。溴化乙锭溶液（）：见附录 。犛 犖犜 w w w.b z f x w.c o m 含 溴化乙锭的 琼脂糖凝胶：见附录 。上样缓冲液：见附录 。焦碳酸乙二酯。阳性对照：星状病毒阳性样本，或者选用含有星状病毒目的基因的质粒作为阳性对照，星状病
8、毒目的基因序列参见附录。引物和探针：普通 和实时荧光 共用同一套引物；引物和探针核苷酸序列详见表。用无 的去离子水配制成 的贮存液。表普通 犚 犜 犘 犆 犚和实时荧光 犚 犜 犘 犆 犚检测所用引物和探针引物探针名称序列（）作用扩增片段大小 （）上游引物 （）上游引物 （）上游引物 （）上游引物 （）下游引物 （）下游引物 （）探针 （）探针 （）探针 （）探针 注：引物和探针设计参照型星状病毒 病毒株衣壳蛋白编码基因 端序列，基因库（）检索号 。注：实时荧光 探针的 端用 进行标记，端用 进行标记，也可以根据情况用其他基团进行标记。仪器与设备 组织匀浆器。仪。实时荧光 仪。凝胶成像系统。空
9、气浴振荡摇床：，。涡流混匀器。电泳仪。酸度计。电子天平：量程，感量。高速冷冻离心机：，犵。微量可调加样器：，。低温冰箱：和。无 的玻璃容器：见附录 。无 离心管：、和 ，见附录 。无 管：，见附录 。犛 犖犜 w w w.b z f x w.c o m 无 液器吸头：、和 ，见附录 。磁性抽提架：适用于 离心管。无菌剪子和镊子。磁力搅拌器。生物安全柜。实验室要求实验室设施应达到 的要求。星状病毒检测流程图为贝类中星状病毒的检验流程图。图星状病毒的检测流程制取样方法 样品的运输与保存储存和运输过程中保持样品温度在。实验室接到样品后应尽快进行检测。如果暂时不犛 犖犜 w w w.b z f x w
10、.c o m能检测应将样品保存于 冰箱中，避免样品的反复冻融。取样首先用灭菌蒸馏水将贝壳表面的污泥清洗干净，打开贝壳后，倒掉腔内的液体，使用灭菌消毒的剪刀和镊子取贝类消化腺组织。制样 在消化腺组织中加入 匀浆缓冲液（），匀浆器充分匀浆 。将匀浆液置于 空气浴振荡摇床中，振荡 ；，犵，离心 。病毒的检测 犌 犘 犜 犜法提取病毒 犚 犖 犃 将 上清液全部移至无 的 离心管中（可以分装于个 离心管），加入等体积 的 溶液（终浓度为），颠倒混匀。冰上放置至少。，犵，离心 ，弃上清液。加入 ，用枪头吹打或剧烈涡旋振荡的方式使沉淀充分溶解，室温放置 。将溶解的沉淀转移至 或 无 的离心管中，加入 三氯
11、甲烷，剧烈涡旋混匀 ，室温放置 。，犵离心 ，小心吸取上清液至无 的 离心管中。加入 倍体积异丙醇，上下颠倒充分混匀后室温放置 。，犵离心 ，弃上清液，用预冷的 乙醇洗涤沉淀。加入 无 去离子水，加热 ，使沉淀完全溶解，得到总 。按照?（）使用说明从总 中纯化病毒 ，也可按照其他等效产品说明书进行：）将 所得的 溶液置于 温育 ，立即置于冰上（打开二级结构）；）磁珠的处理：取 充分悬浮的 （）磁珠至 无 离心管中，磁性抽提架上放置，吸弃上清液。加 吸附缓冲液充分重悬、洗涤磁珠，磁性抽提架上放置，吸弃上清液。重复洗涤一次，最终以 吸附缓冲液重悬磁珠。）将 所得的 磁珠加入 的 溶液中，充分混匀，
12、室温放置 。将离心管置于磁性抽提架上 ，吸弃上清液。）加入 漂洗缓冲液重悬磁珠，磁性抽提架上放置 ，吸弃上清液（尽量吸尽液体）。）加入 充分重悬磁珠，加热 后立即于磁性抽提架上放置 ，将上清液移至无 的 离心管中，即纯化的病毒 。纳米磁珠法提取病毒 犚 犖 犃 取 上清液 转移到 离心管中，加入 溶液（终浓度为），颠倒次混匀。冰上放置至少。，犵，离心 ，弃上清液，向沉淀中加入 结合缓冲液，涡流混匀，尽量使沉淀充分溶解。纳米磁珠的处理：取 充分悬浮的纳米磁珠至 无 的离心管中，按照 ）的方法利用结合缓冲液洗涤纳米磁珠两次，最终将其重悬于 结合缓冲液中。将 的纳米磁珠加入 的悬液中，充分混匀，室温
13、下放置 ，每隔 ，颠倒混匀几次。将离心管放置于磁性抽提架上，吸附纳米磁珠 ，弃上清液。加入 核酸释放液，使磁珠充分悬浮，加热 ，立即置于冰上冷却 。，犛 犖犜 w w w.b z f x w.c o m 犵离心 ，将含有病毒 的上清液转移至无 的 离心管中，进行普通或实时荧光 检测，也可暂时于 冰箱保存备用。星状病毒的定性检测星状病毒的定性检测采用普通 和两步法实时荧光 方法。逆转录使用 试剂盒进行逆转录反应，反应体系及反应条件见表，反应体系中各试剂的量可根据具体情况进行适当的调整。表逆转录反应体系与反应条件名称工作液浓度终浓度加样量 下游引物 下游引物 水上述混合物于，温育 ；立即置于冰上
14、。缓冲液 总体积 逆转录反应条件：，；，；立即置于冰上，此时得到的是病毒 。普通犘 犆 犚方法 普通 犚 犜 犘 犆 犚反应体系普通 反应体系见表。以星状病毒 或含星状病毒目的基因的质粒作为阳性对照，以不含有星状病毒的贝类 作为阴性对照，以水代替模板作为空白对照，每个反应体系设置两个平行，反应体系浓度可做相应调整。表普通 犚 犜 犘 犆 犚反应体系名称储存液浓度终浓度加样量 缓冲液 上游引物（）条上游引物各加下游引物（）条下游引物各加犜 犪 狇酶 无菌水 总体积 普通 犚 犜 犘 犆 犚反应循环参数普通 反应循环参数见表，不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。犛 犖犜 w w w.b z
15、 f x w.c o m表普通 犚 犜 犘 犆 犚反应参数变性扩增条件循环次数延伸 ，犘 犆 犚产物的琼脂糖凝胶电泳检测将适量 稀释成 溶液，配制溴化乙锭含量为 的 琼脂糖凝胶。取 产物，加 上样缓冲液点样，在琼脂糖凝胶的两边或中间位置点样 分子量标记，用来判断 产物片断的大小。电泳电压根据电泳槽的长度来确定，一般控制在 ，当电泳指示剂溴酚蓝移动到凝胶边缘时关闭电源，电泳结果检测采用凝胶成像系统。实时荧光犘 犆 犚检测 实时荧光犘 犆 犚反应体系使用 （）试剂盒进行两步法实时荧光 ，实时荧光 反应体系见表，也可使用其他等效的荧光 检测试剂盒。以星状病毒 或含星状病毒目的基因的质粒作为阳性对照，
16、以不含有星状病毒的贝类 作为阴性对照，以水代替模板作为空白对照，每个反应体系设置两个平行，反应体系浓度可做相应调整。表实时荧光 犚 犜 犘 犆 犚反应体系名称储存液浓度终浓度加样量 上游引物（）各下游引物（）各探针（）各 水（无 ）总体积 实时荧光犘 犆 犚反应循环参数实时荧光 反应参数见表。表实时荧光 犚 犜 犘 犆 犚反应参数酶作用热启动扩增条件循环次数 ，注：不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。结果判定及表述 普通犘 犆 犚结果的判定 对照结果）阳性对照：有扩增条带；）阴性对照：无扩增条带；）空白对照：无扩增条带；犛 犖犜 ）否则，实验视为无效。检测结果判定 同时进行的阴性、阳性和空白对照实验结果正常，待检样品无扩增条带，则判断样品中未检出星状病毒。同时进行的阴性、阳性和空白对照实验结果正常，待检样品有扩增条带，进一步通过荧光 方法进行验证，荧光 方法验证结果为阳性，则可判定样品检出星状病毒；或对 产物进行测序分析比对，产物核酸序列与星状病毒 序列相一致，则可判定样品检出星状病毒。荧光犘 犆 犚结果的判定 对照结果）阳性对照：有荧光增幅现象；）阴性对照：无荧光增幅现象；）
