1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 进出口蜂王浆中四环素类兽药残留量检测方法液相色谱 质谱 质谱法犇 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳 狋 犲 狋 狉 犪 犮 狔 犮 犾 犻 狀 犲 狊 狉 犲 狊 犻 犱 狌 犲 狊 犻 狀狉 狅 狔 犪 犾 犼 犲 犾 犾 狔犳 狅 狉 犻 犿 狆 狅 狉 狋 犪 狀 犱犲 狓 狆 狅 狉 狋犎 犘 犔 犆 犕 犛犕 犛犿 犲 狋 犺 狅 犱 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国浙江出入境检
2、验检疫局。本标准主要起草人：陈笑梅、黄超群、谢文、丰金平、刘海山。犛 犖犜 进出口蜂王浆中四环素类兽药残留量检测方法液相色谱 质谱 质谱法范围本标准规定了蜂王浆中土霉素（，）、四环素（，）、去甲金霉素（，）、金霉素（，）和强力霉素（，）残留量的液相色谱 串联质谱测定方法。本标准适用于蜂王浆中土霉素、四环素、去甲金霉素、金霉素和强力霉素残留量的测定。方法提要试样中的待测抗生素用 缓冲液提取，甲醇沉淀样品中的蛋白质，清液过 固相萃取柱和 型离子交换柱净化。液相色谱 串联质谱法测定样品中的待测物，外标法定量。试剂和材料除另有规定外，试剂均为分析纯，水为超纯水。甲醇：液相色谱级试剂。乙腈：液相色谱级试
3、剂。乙酸乙酯：液相色谱级试剂。草酸（）。磷酸氢二钠。柠檬酸（）。乙二胺四乙酸二钠（）。氢氧化钠。磷酸氢二钠溶液：称取 磷酸氢二钠溶于适量水，再定容至 。柠檬酸溶液：称取 柠檬酸溶于适量水，再定容至 。缓冲溶液：将 磷酸氢二钠溶液（）与 柠檬酸溶液（）混合，用磷酸调节 。缓冲溶液：称取 乙二胺四乙酸二钠，加入 缓冲溶液（）中，使其溶解摇匀。氢氧化钠溶液：。（体积分数）甲醇水溶液，将 甲醇与 水混合摇匀。甲醇 乙酸乙酯混合液：将 甲醇与 乙酸乙酯混合摇匀。草酸溶液：称取 草酸溶于适量水，再定容至 。草酸 乙腈混合液（，体积比）：将 草酸溶液（）与 乙腈混合摇匀。四环素族抗生素标准品：土霉素盐酸盐（
4、）纯度大于等于 ，四环素盐酸盐（）纯度大于等于 ，去甲金霉素盐酸盐（）纯度大于等于 ，金霉素盐酸盐（）纯度大于等于 ，强力霉素（）纯度大于等于 。犛 犖犜 标准储备液：分别称取 ，用甲醇溶解并定容到 容量瓶中，溶液浓度为 ，保存，有效期个月。混合标准中间液：分别准确移取适量 、储备液（），用甲醇稀释定容为 ，保存，有效期个月。混合标准工作溶液：根据需要，将中间液（）用阴性样品处理液稀释至适当浓度的工作溶液。固相萃取柱：，。使用前分别用 甲醇和 水预洗并保持柱体湿润。离子交换柱：型固相萃取柱，。使用前用 乙酸乙酯预洗并保持柱体湿润。仪器和设备 液相色谱 质谱质谱联用仪：配有电喷雾离子源（）。离心
5、机（犵）。混匀器。真空固相萃取装置。计。具盖塑料离心管：。电子天平。制样 试样的制备将抽取的样品充分混匀，均分成两份，分别装入洁净容器内，一份作为留样保存，另一份作为试样供检测用。在制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生含量的变化。试样的保存试样宜及时检测，在不能及时检测的情况下，应置于 以下冷冻保存。测定步骤 提取称取蜂王浆（精确至 ），置于 离心管中，加入 缓冲溶液，在混匀器上混匀 ，再加入 甲醇混匀，离心（犵），上层清液转移到 容量瓶中。下层沉淀加 缓冲溶液，混匀 ，离心（犵）后，把上层清液转移到 容量瓶中。重复操作一次。用 缓冲溶液把提取液定容至 。取 移入离心管中，用 氢氧化钠溶
6、液调节 为，待净化用。犎 犔 犅固相萃取柱净化将上述提取液过预先淋洗好的 固相萃取柱，再用 甲醇水溶液（）淋洗，减压抽干 ，弃去全部淋出液。加 甲醇 乙酸乙酯混合液（）以 的流速洗脱，收集洗脱液，摇匀。犛 犖犜 离子交换柱净化将上述溶液转入预洗好的离子交换柱（），再用 甲醇淋洗，减压抽干 ，弃去全部淋出液。用 草酸 乙腈混合液（）以 的流速洗脱，收集洗脱液，摇匀，供液相色谱 质谱质谱联用仪测定。测定 液相色谱 质谱质谱仪条件 色谱柱：柱，（内径）或相当者。流动相梯度洗脱条件见表。表梯度洗脱条件时间 乙腈 草酸溶液 流速：。进样量：。离子源：电喷雾离子源。扫描方式：正离子扫描。检测方式：多反应监
7、测。雾化气、气帘气、辅助气、碰撞气均为高纯氮气；使用前应调节各参数使质谱灵敏度达到检测要求，参考条件见附录。色谱测定根据样液中待测物的含量情况，选取响应值相近的标准工作液进行色谱分析。标准工作液和样液中待测物的响应值均应在校正曲线线性响应范围内。在上述色谱条件下 、和 的参考保留时间约为 、和 。标准品多反应监测（）色谱图参见附录。外标法定量。空白试验除不加试样外，均按上述步骤进行。结果计算和表述用色谱数据处理机或按式（）计算试样中待测物含量。犛 犖犜 犡犃犮犞犃犿（）式中：犡 试样中待测物的残留量，单位为微克每千克（）；犃 样液中待测物的峰面积；犮 标准工作液中待测物的浓度，单位为纳克每毫升
8、（）；犞 样液最终体积，单位为毫升（）；犃 标准工作液中待测物的峰面积；犿 最终样液所代表的试样量，单位为克（）。测定低限和回收率 测定低限本方法对蜂王浆中土霉素、四环素、去甲金霉素、金霉素、强力霉素的测定低限均为 。回收率添加浓度在 、时，五种抗生素残留量测定的回收率如表。表五种抗生素残留量测定的回收率被测物添 加 浓 度 犛 犖犜 附录犃（资料性附录）优化后的质谱条件）犃 气帘气压力（）：。犃 雾化气压力（）：。犃 辅助气压力（）：。犃 电喷雾电压（）：。犃 离子源温度（）：。犃 碰撞气压力（）：。犃 入口电压（）：。犃 碰撞室出口电压（）：。犃 质谱条件见表 。表犃 质谱条件名称定量离子
9、对定性离子对保留时间 去簇电压（）碰撞气能量（）土霉素 四环素 去甲金霉素 金霉素 强力霉素 ）非商业性声明：附录所列参数是在 质谱仪完成的，此处列出试验用仪器型号仅是为了提供参考，并不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试不同厂家和型号的仪器。犛 犖犜 附录犅（资料性附录）五种四环素族抗生素标准品多反应监测（犕犚犕）色谱图 土霉素；四环素；去甲金霉素；金霉素；强力霉素。图犅 五种四环素族抗生素标准品多反应监测（犕犚犕）色谱图犛 犖犜 犉 狅 狉 犲 狑 狅 狉 犱犜 犺 犻 狊狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱狑 犪 狊犱 狉 犪 犳 狋 犲 犱 犻 狀犪 犮 犮 狅 狉 犱 犪 狀 犮 犲狑 犻 狋
10、 犺狋 犺 犲犌 犅犜 犜 犺 犻 狊狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱狑 犪 狊狆 狉 狅 狆 狅 狊 犲 犱犫 狔犪 狀 犱 犻 狊狌 狀 犱 犲 狉 狋 犺 犲犮 犺 犪 狉 犵 犲狅 犳犆 犲 狉 狋 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀犪 狀 犱犃 犮 犮 狉 犲 犱 犻 狋 犪 狋 犻 狅 狀犪 犱 犿 犻 狀 犻 狊 狋 狉 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳 狋 犺 犲犘 犲 狅 狆 犾 犲狊犚 犲 狆 狌 犫 犾 犻 犮狅 犳犆 犺 犻 狀 犪 犜 犺 犻 狊狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱狑 犪 狊犱 狉 犪 犳 狋 犲 犱犫 狔犣 犺 犲 犼 犻 犪 狀 犵犈 狀 狋 狉 狔 犈 狓 犻
11、狋 犐 狀 狊 狆 犲 犮 狋 犻 狅 狀犪 狀 犱犙 狌 犪 狉 犪 狀 狋 犻 狀 犲犅 狌 狉 犲 犪 狌狅 犳狋 犺 犲犘 犲 狅 狆 犾 犲狊犚 犲 狆 狌 犫 犾 犻 犮狅 犳犆 犺 犻 狀 犪 犜 犺 犲犿 犪 犻 狀犱 狉 犪 犳 狋 犲 狉 狊狅 犳狋 犺 犻 狊狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱犪 狉 犲犆 犺 犲 狀 犡 犻 犪 狅 犿 犲 犻，犎 狌 犪 狀 犵 犆 犺 犪 狅 狇 狌 狀，犡 犻 犲 犠 犲 狀，犉 犲 狀 犵犑 犻 狀 狆 犻 狀 犵，犔 犻 狌犎 犪 犻 狊 犺 犪 狀 犛 犖犜 犇 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳 狋 犲 狋 狉
12、 犪 犮 狔 犮 犾 犻 狀 犲 狊狉 犲 狊 犻 犱 狌 犲 狊 犻 狀狉 狅 狔 犪 犾 犼 犲 犾 犾 狔犳 狅 狉 犻 犿 狆 狅 狉 狋犪 狀 犱犲 狓 狆 狅 狉 狋犎 犘 犔 犆 犕 犛犕 犛犿 犲 狋 犺 狅 犱犛 犮 狅 狆 犲犜 犺 犻 狊狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱狊 狆 犲 犮 犻 犳 犻 犲 狊狋 犺 犲犱 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳狅 狓 狔 狋 犲 狋 狉 犪 犮 狔 犮 犾 犻 狀 犲（犗 犜 犆），狋 犲 狋 狉 犪 犮 狔 犮 犾 犻 狀 犲（犜 犆），犱 犲 犿 犲 狋 犺 狔 犾 犮 犺 犾 狅 狉 狋 犲 狋 狉 犪 犮 狔
13、 犮 犾 犻 狀 犲（犇 犕 犆 犜 犆），犮 犺 犾 狅 狉 狅 狋 犲 狋 狉 犪 犮 狔 犮 犾 犻 狀 犲（犆 犜 犆）犪 狀 犱犱 狅 狓 狔 犮 狔 犮 犾 犻 狀 犲（犇 犆）狉 犲 狊 犻 犱 狌 犲 狊 犻 狀狉 狅 狔 犪 犾 犼 犲 犾 犾 狔犫 狔犺 犻 犵 犺 狆 犲 狉 犳 狅 狉 犿 犪 狀 犮 犲 犾 犻 狇 狌 犻 犱犮 犺 狉 狅 犿 犪 狋 狅 犵 狉 犪 狆 犺 狔 狋 犪 狀 犱 犲 犿 犿 犪 狊 狊狊 狆 犲 犮 狋 狉 狅 犿 犲 狋 狉 狔 犜 犺 犻 狊狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱 犻 狊犪 狆 狆 犾 犻 犮 犪 犫 犾 犲 狋 狅狋 犺
14、 犲 犻 狀 狊 狆 犲 犮 狋 犻 狅 狀狅 犳犗 狓 狔 狋 犲 狋 狉 犪 犮 狔 犮 犾 犻 狀 犲，犜 犲 狋 狉 犪 犮 狔 犮 犾 犻 狀 犲，犇 犲 犿 犲 犮 犾 狅 犮 狔 犮 犾 犻 狀 犲，犆 犺 犾 狅 狉 狅 狋 犲 狋 狉 犪 犮 狔 犮 犾 犻 狀 犲犪 狀 犱犇 狅 狓 狔 犮 狔 犮 犾 犻 狀 犲狉 犲 狊 犻 犱 狌 犲 狊 犻 狀狉 狅 狔 犪 犾 犼 犲 狉 狉 狔 犘 狉 犻 狀 犮 犻 狆 犾 犲犜 犲 狋 狉 犪 犮 狔 犮 犾 犻 狀 犲 狊狉 犲 狊 犻 犱 狌 犲 狊犻 狀狋 犲 狊 狋狊 犪 犿 狆 犾 犲犻 狊犲 狓 狋 狉 犪 犮
15、狋 犲 犱狑 犻 狋 犺犈 犇 犜 犃 犕 犮 犐 犾 狏 犪 犻 狀 犲犫 狌 犳 犳 犲 狉狊 狅 犾 狌 狋 犻 狅 狀 犘 狉 犲 犮 犻 狆 犻 狋 犪 狋 犲狋 犺 犲狆 狉 狅 狋 犲 犻 狀 犻 狀狊 犪 犿 狆 犾 犲犫 狔犿 犲 狋 犺 犪 狀 狅 犾 犪 狀 犱狆 狌 狉 犻 犳 狔 狋 犺 犲 犳 犻 犾 狋 犲 狉 犫 狔犎 犔 犅狊 狅 犾 犻 犱狆 犺 犪 狊 犲犲 狓 狋 狉 犪 犮 狋 犻 狅 狀犮 犪 狉 狋 狉 犻 犱 犵 犲犪 狀 犱 犻 狅 狀犲 狓 犮 犺 犪 狀 犵 犲犮 狅 犾 狌 犿 狀 犇 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狋 犺
16、 犲狋 犲 狋 狉 犪 犮 狔 犮 犾 犻 狀 犲 狊犫 狔犎 犘 犔 犆狑 犻 狋 犺犜 犪 狀 犱 犲 犿 犕 犪 狊 狊犛 狆 犲 犮 狋 狉 狅 犿 犲 狋 狉 狔，狌 狊 犻 狀 犵犲 狓 狋 犲 狉 狀 犪 犾 狊 狋 犪 狀 犱 犪 狉 犱犿 犲 狋 犺 狅 犱犚 犲 犪 犵 犲 狀 狋 狊犪 狀 犱犿 犪 狋 犲 狉 犻 犪 犾 狊犝 狀 犾 犲 狊 狊狅 狋 犺 犲 狉 狑 犻 狊 犲狊 狆 犲 犮 犻 犳 犻 犲 犱，犪 犾 犾 狉 犲 犪 犵 犲 狀 狋 狊狊 犺 狅 狌 犾 犱犫 犲犪 狀 犪 犾 狔 狋 犻 犮 犪 犾 犾 狔狆 狌 狉 犲，狑 犪 狋 犲 狉 狌 狊 犲 犱狊 犺 狅 狌 犾 犱犫 犲狌 犾 狋 狉 犪 狆 狌 狉 犲狑 犪 狋 犲 狉 犕 犲 狋 犺 犪 狀 狅 犾：犎 犘 犔 犆犵 狉 犪 犱 犲 犃 犮 犲 狋 狅 狀 犻 狋 狉 犻 犾 犲：犎 犘 犔 犆犵 狉 犪 犱 犲 犈 狋 犺 狔 犾 犪 犮 犲 狋 犪 狋 犲：犎 犘 犔 犆犵 狉 犪 犱 犲 犗 狓 犪 犾 犻 犮犪 犮 犻 犱（犆犎犗 犎犗）犛 狅 犱 犻 狌 犿犺 狔
