1、ICS 65.150 B 50 DB37 山东省地方标准 DB37/T 40582020 水生动物细菌性病原检测技术规范 Inspection protocol for bacterial pathogens of aquatic animals 2020-07-09 发布 2020-08-09 实施 山东省市场监督管理局 发 布 DB37/T 40582020 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利,本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施。本标准由山东省渔业标准化委员会(鲁TC03)归口。本标
2、准起草单位:威海海洋职业学院、山东省渔业技术推广站、中国科学院水生生物研究所、江苏省渔业技术推广中心、威海市渔业技术推广站。本标准主要起草人:侯仕营、刘朋、刘晓燕、李爱华、董济军、刘缵延、吴亚锋、马湘君、尹相菡、刘振华。DB37/T 40582020 1 水生动物细菌性病原检测技术规范 1 范围 本标准规定了水生动物细菌性病原(Bacterial pathogens of aquatic animals)检测的试剂与材料、仪器设备、采样、细菌性病原分离培养和病原菌检测。本标准适用于山东省水生动物常见细菌性病原检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,
3、仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB 4789.28 食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求 SC/T 70142006 水生动物检疫实验技术规范 SC/T 7201.1 鱼类细菌病检疫技术规程 第1部分:通用技术 SN/T 2123 出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范 3 试剂与材料 试剂与材料应符合GB 4789.28和附录A的规定。4 仪器设备 按照SC/T 7201.1的规定执行。5 采样 5.1 采样用具 应使用无菌采样用具。5.2 采样数量、个体要求、采集部位 按照SC/T 7014200
4、6中第6章的规定执行。5.3 样品运输及保存 按照SN/T 2123的规定执行。6 细菌性病原分离培养 6.1 分离培养 DB37/T 40582020 2 6.1.1 兼性厌氧菌和需氧菌的分离培养 规范取样后,采用稀释倒平板法、涂布平板法、平板划线法等方式,在28 30 培养24 h;低温下取样应在15 18 同步培养24 h。6.1.2 厌氧菌的分离培养 将处理好的平板置于玻璃干燥器,并在其上方放置连二亚硫酸钠和无水碳酸钠(分别研细均匀,临用前混合置于一平皿内)各30 g/1 000 mL容积,然后将干燥器盖严,用凡士林密封,在28 30 培养24 h;低温下取样则应在15 18 同步培养
5、24 h。严格厌氧菌的分离培养应在厌氧工作台中进行。6.2 纯培养 6.2.1 兼性厌氧菌和需氧菌的纯培养 挑取单菌落,接种于相应培养基上,按照6.1.1的方法培养。6.2.2 厌氧菌的纯培养 挑取单菌落,接种于相应培养基上,按照6.1.2的方法培养。6.3 多次纯培养 若经过纯培养后,未能得到形态特征基本一致的单菌落,可进行多次纯培养,直到获得形态特征基本一致的单菌落,操作步骤应符合6.2的要求。7 病原菌检测 7.1 病原菌 16S rDNA 序列分析 7.1.1 菌落 PCR 按照附录B执行。7.1.2 结果判定 7.1.2.1 PCR 结果可靠 DNA Marker标准样品出现清晰的梯
6、度条带,阳性对照可见1472 bp左右DNA条带,且阴性和空白对照样品无条带出现,则PCR实验结果可靠,可进行样品分析。7.1.2.2 电泳失败 DNA Marker标准样品未出现条带,则电泳失败,应检查电泳试剂重新进行电泳。7.1.2.3 检测结果无效 DNA Marker标准样品出现清晰的梯度条带,阳性对照无条带或者DNA条带非1472 bp左右,或者在阴性对照和空白对照样品中出现了DNA条带,则试验结果无效,应重新进行PCR扩增。7.1.3 克隆、测序和比对 DB37/T 40582020 3 将7.1.2样品扩增条带克隆、测序,序列输入到NCBI网站进行比对,确定细菌的属种。7.2 病
7、原菌生化特性检测 按照SC/T 70142006中的9.4规定执行。7.3 结果综合判定 需要鉴定病原菌到属依据7.1.3结果进行判定,需要进一步鉴定到种应结合7.2结果进行综合判定。DB37/T 40582020 4 A A 附 录 A(规范性附录)试剂的配制 A.1 TE缓冲液 A.1.1 A液:1 mol/L TrisHCl(pH8.0)称取Tris碱6.06 g,加去离子水40 mL溶解,滴加浓HCl约2 mL调pH至8.0,定容至50 mL。A.1.2 B液:0.5 mol/L EDTA(pH8.0)称取Na2EDTA2H2O 9.31 g,加超纯水35 mL,剧烈搅拌,用约1 g
8、NaOH颗粒调pH至8.0,定容至50 mL(Na2EDTA2H2O需加入NaOH将pH调至接近8.0时才会溶解)。A.1.3 TE缓冲液 量取A液5 mL,B液1 mL于烧杯中,加400 mL去离子水混合,调pH至8.0,定容至500 mL。A.2 1TAE缓冲液 称取Tris 242.0 g,Na2EDTA 2H2O 37.2 g于1 L烧杯中,加800 mL去离子水充分搅拌溶解,再加入57.1 mL醋酸,充分混匀。最后以去离子水定容至1 000 mL即为50TAE缓冲液,使用时稀释50倍即可。DB37/T 40582020 5 B B 附 录 B(规范性附录)菌落 PCR 测定 B.1
9、制备DNA模板 用无菌牙签挑取单个菌落到0.2 mL PCR管中,加入10 L无菌1TE(见附录A.1)缓冲液弹击混匀,标记,盖紧,100 煮沸5 min,-20 冷冻5 min(循环2次),5 000 r/min离心1 min,取上清液检测DNA模板浓度,用于后续PCR扩增。当样本量少时也可采用合适的试剂盒制备DNA模板。B.2 PCR扩增 采用50 L PCR反应体系:DNA模板浓度范围为0.2 ng/L2 ng/L,(用核酸测定仪测定DNA模板浓度,根据浓度值计算模板添加体积),10PCR Buffer(含Mg2+1.5 mM)5 L,dNTP(10 mM)1 L,上游引物(27F):5
10、AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3,下游引物(1492R):5TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T 3(25 M)各2 L,Taq酶(2 U/L)1 L2 L,去离子水补至50 L,混匀,稍离心。反应管置于PCR仪中,首先95 预变性5 min;主循环30次:94 30 s,50 退火30 s,72 30 s(时间可根据片段长度调整);终延伸72 10 min,4 保存。注:不同细菌PCR程序可不同。B.3 电泳检测 设置阳性样品对照(如大肠杆菌DNA)、阴性样品(如鱼的基因组DNA或细菌质粒DNA)对照、空白对照(无DNA)。1TAE(见附录A.2)缓冲液配置含核酸染料的2%琼脂糖凝胶,PCR扩增产物与6上样缓冲液混合,同时以DL2000或同等大小的DNA Marker标准样品为对照。10 V/cm电泳30 min,凝胶成像系统拍摄电泳结果。_