1、ICS 11.220B 41备案号:38105-2013DB42湖北省地方标准DB42/T 8942013猪胸膜肺炎放线杆菌 Apx-ELISA 抗体检测方法Enzyme-linked immunosorbent assay to detect the antibody against Apx ofActinobacillus pleuropneumoniae2013-03-14 发布2013-06-01 实施湖北省质量技术监督局发 布DB42/T 8942013I目次前言.II引言.III1范围.12规范性引用文件.13缩略语.14检测原理.15检测条件.26检测材料.27检测方法.28结果
2、判定.39注意事项.3附录 A.4附录 B.6DB42/T 8942013II前言本文件按照 GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写给出的规则起草。本标准由华中农业大学提出。本标准由湖北省农业厅归口。本标准起草单位：华中农业大学、武汉科前动物生物制品有限责任公司、湖北省动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：周锐、金梅林、陈焕春、宋念华、董晓辉、金卉。DB42/T 8942013III引言猪传染性胸膜肺炎（porcine contagious pleuropneumonia）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacilluspleuropneumoniae,A
3、PP）引起的一种猪的重要呼吸道传染病，以纤维性、出血性、坏死性胸膜炎和肺炎为主要特征，多呈急性经过，导致感染猪急性死亡。急性感染耐过猪或隐性感染猪会影响日增重，延迟出栏时间。本病呈世界性分布，是危害养猪业最严重的呼吸道细菌性传染病之一。ApxIVA 是 APP 特异性的体内诱导抗原。本标准以 ApxIVA 重组蛋白为抗原建立的间接 ELISA 抗体检测方法，不仅适用于 APP 感染的特异性诊断，而且可以用于区分 APP 灭活疫苗或 ApxIV 基因缺失疫苗免疫猪与自然感染猪的鉴别诊断。本标准参照国家二类新兽药“猪胸膜肺炎放线杆菌 ApxIV-ELISA 抗体检测试剂盒”（2010 新兽药证字
4、49 号）的质量标准及其使用说明书制定，为国内首次提出。DB42/T 89420131猪胸膜肺炎放线杆菌 Apx-ELISA 抗体检测方法1范围本标准规定了猪胸膜肺炎放线杆菌 Apx抗体的酶联免疫吸附试验（ELISA）检测方法的缩略语、检测原理、检测条件、检测材料、检测方法、结果判定和注意事项等。本标准适用于猪血清中胸膜肺炎放线杆菌 Apx的抗体的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。兽用生物制品质量标准汇编（2010）猪传染性胸膜肺炎放线杆菌Apx-E
5、LISA抗体检测试剂盒质量标准。GB/T 6682-2008 中国实验室用水国家标准。3缩略语下列缩略语适用于本标准。猪胸膜肺炎放线杆菌 Actinobacillus pleuropneumoniaeAPP胸膜肺炎放线杆菌 ApxIV 毒素的 A 蛋白ApxIVA酶联免疫吸附试验 Enzyme-linked immunosorbent assayELISA630 纳米波长处的吸光值OD630nm 值阳性对照孔 OD630nm 值的平均值P样品孔 OD630nm 值S4检测原理ApxIVA 毒素是 APP 种特异性的外毒素，但在体外培养 APP 时并不能够检测到 ApxIVA 毒素，只有在感染猪
6、体内才能够检测到 ApxIVA 毒素及其抗体，因此，通过检测猪血清中 ApxIVA 毒素的抗体，可以诊断猪是否感染了 APP。APP 的 ApxIVA 抗体 ELISA 检测技术是利用被检样品中的抗体与包被在酶标板上的 ApxIVA 抗原发生反应，然后通过洗涤把未结合的抗体及其他物质去除。再加入羊抗猪 IgG 酶标抗体，酶标抗体与抗原抗体复合物结合，加入底物后，底物被酶催化成有色产物，产物的颜色深浅与样品中抗体的量呈正相关，故可根据 OD630nm值判定被检样品中 ApxIVA 的抗体水平。5检测条件DB42/T 894201325.1环境温度检测过程宜在室温（18 25）进行。5.2主要仪器
7、台式低温离心机、微量移液器、2 8 冰箱、恒温箱、酶标检测仪。6检测材料猪胸膜肺炎放线杆菌重组 ApxIVA 蛋白、阳性对照血清、阴性对照血清、羊抗猪 IgG 酶标抗体、96孔酶标板、包被液、封闭液、样品稀释液、洗涤液、底物液 A、底物液 B、终止液。试剂的配制见附录A。7检测方法7.1样品处理取待检测猪的血液，待血液凝固后，以 4000 r/min 离心 10 min，收集血清。也可采集血液，待凝固后自然析出血清。血清呈淡黄色，无严重溶血。具体血液采集与样品处理注意事项见附录 B。7.2包被用包被液将抗原（猪胸膜肺炎放线杆菌重组 ApxIVA 蛋白）稀释到工作浓度（6.25 g/mL）加入酶
8、标板孔内，每孔 100 L，37 孵育 1 h 后，再置 2 8，8 h10 h。7.3封闭取出抗原包被板，弃去孔中包被液，在干净的吸水纸上拍干。每孔加入洗涤液 120 L，静置 3 min，弃去洗涤液后拍干，重复洗涤 3 次。然后加封闭液，200 L/孔，于 37 封闭 2 h，甩干封闭液，自然干燥。于 2 8 保存（密封可保存 6 个月）。7.4样品稀释将待检血清用样品稀释液按 1:40 的比例稀释（195 L 样品稀释液中加 5 L 待检血清），对照血清用血清稀释液按 1:4 的比例稀释（180 L 样品稀释液中加 60 L 对照血清）。7.5加样将稀释好的待检血清和对照血清各取 100
9、 L 加入到抗原包被板的孔中，待检血清作 1 孔，阴性对照和阳性对照各作 2 孔，轻轻振匀孔中样品（勿溢出），置 37 下孵育 30 min。7.6洗涤弃去 96 孔酶标板孔中的溶液，加入洗涤液 200 L/孔，静置 3 min 后弃去洗涤液，并在干净的吸水纸上拍干，重复洗涤 5 次。7.7加酶标抗体DB42/T 89420133每孔加酶标抗体 100 L，置 37 下孵育 30 min，按 7.6 中的方法洗涤 5 次。7.8加底物每孔先加底物液 A50 L，再加底物液 B 50 L，轻轻振荡混匀，室温（18 25）避光显色 10min。7.9终止反应每孔加终止液 50 L，轻轻振荡混匀，1
10、0 min 内测定结果。7.10测定吸光值在酶标检测仪上于 630 nm 波长处测定各孔的 OD630nm值。8结果判定结果成立的条件：阳性对照孔 OD630nm值均 0.8，且 1.6；阴性对照孔 OD630nm值均 0.2。如果 S P0.25，判为阳性；如果 S P0.25，判为阴性。9注意事项检测过程中注意做好个人的生物安全防护措施，废弃物做无害化处理（详见附录 B）。DB42/T 89420134AA附录A（规范性附录）试剂的配制A.1酶标抗体将羊抗猪 IgG 酶标抗体（Southern Biotechnology Associates（SBA）公司）用样品稀释液按1:5000稀释，
11、置4 保存可使用 7 天。A.2包被液碳酸钠（Na2CO3）1.59 g碳酸氢钠(NaHCO3)2.93 g加蒸馏水至1000 mL置 2 8 下保存备用。A.3封闭液牛血清白蛋白（BSA）0.5 g蔗糖（C12H22O11）1.0 g加洗涤液至100 mL置 2 8 下保存备用。A.4样品稀释液牛血清白蛋白（BSA）0.5 g加洗涤液至100 mL置28下保存备用。A.5洗涤液氯化钠（NaCl）8.0 g氯化钾（KCl）0.2 g磷酸氢二钠(Na2HPO412H2O)2.9 g磷酸二氢钠（NaH2PO4）0.2 g吐温-20（Tween-20）0.5 mL加蒸馏水至1000 mL置28下保存
12、备用。A.6底物液A磷酸氢二钠（Na2HPO4）14.60 g柠檬酸（C6H8O7）9.33 gDB42/T 89420135过氧化脲（CH6N2O3）0.52 g加蒸馏水至1000 mL用HCl调pH值至5.05.4，置2 8 下保存备用。A.7底物液B四甲基联苯胺（TMB）20 mg无水乙醇（C2H6O）10 mL加蒸馏水至1000 mL置2 8 下避光保存备用。A.8终止液40%的氢氟酸(HF)625 L加蒸馏水至100 mL置2 8 下保存备用。DB42/T 89420136BB附录B（规范性附录）注意事项B.1 血样采集及处理过程，应进行无菌操作，防止样本因污染发生变质。存放血样的容器应无菌，可使用一次性灭菌容器。B.2 血液自然凝固后无菌分离血清装入灭菌离心管或小瓶中，加盖密封后置 2 8 下冷藏保存。每份血清样品贴标签并写明编号、采集地点、免疫背景、时间等，以便通过抗体检测，做出追溯性诊断。B.3 采样及检测过程，应穿工作服，戴口罩和一次性手套。B.4 血样处理及检测过程中产生的废弃物应放入专门的废弃物容器，废弃物经高压消毒后按有关规定处理。B.5 应符合病原微生物实验室生物安全管理条例的其它生物安全技术要求。_DB42/T 8942013
