1、 ICS 65.020.20 B 16 DB45 广西壮族自治区地方标准 DB 45/T 21722020 甘蔗黑穗病的鉴定方法 PCR 法 Method of PCR method for detection of sugarcane smut 2020-10-29 发布 2020-11-30 实施广西壮族自治区市场监督管理局 发 布 DB45/T 21722020 I 目 次 前 言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 缩略语.1 5 原理.2 6 材料和试剂.2 7 仪器和设备.3 8 引物.3 9 操作步骤.3 10 结果判定.4 附录 A（资料性）样品
2、检测电泳图.5 DB45/T 21722020 III 前 言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由广西壮族自治区分析测试研究中心提出并宣贯。本文件由广西糖业标准化技术委员会归口。本文件起草单位：广西益谱检测技术有限公司、广西博测检测技术服务有限公司、广西吉锐安全技术有限公司、广西壮族自治区分析测试研究中心。本文件主要起草人：梁俊、苏丽梅、刘守廷、龙智翔、黄易勤、黄小娟、刘月东、刘巧频、杨振媚、黄芳、朱玉连、韦秀兰。DB45/T 21722020 1 甘蔗黑穗病的鉴定方法 PCR 法 1 范围 本文件规定了甘蔗黑穗病的PCR
3、检测方法。本文件适用于甘蔗组培苗、种苗、种茎及大田植株黑穗病菌的分子检测及判定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 甘蔗黑穗病 甘蔗黑穗病是一种普遍存在于大多数植蔗国家和地区的主要甘蔗病病害，病原菌是真菌中的担子菌门黑粉菌属甘蔗鞭黑粉菌，甘蔗黑穗病借气流、雨水、灌溉水、人事活动等在田间进
4、行传播扩散，浸染甘蔗芽与分蘖，产生一条黑色穗状物，造成甘蔗产量和含糖量大幅降低。3.2 聚合酶链式反应（PCR）PCR反应（Polymerse Chain Reaction,聚合酶链式反应）是在变性、退火、延伸三个温度下，利用单链寡核苷酸引物对特异DNA片段进行体外快速扩增，在短时间内使目的片段的扩增量达到数千万倍，从极微量的DNA起始，扩增出g级的PCR产物。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）；DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid）；dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ribonu
5、cleoside triphosphate）。DB45/T 21722020 2 5 原理 甘蔗黑穗病病原菌产生孢子，分布在甘蔗植株内外，通过提取甘蔗黑穗病孢子的DNA，设计特定引物，利用PCR检测技术对甘蔗黑穗病DNA进行体外扩增检测，可得到准确的鉴定结果。6 材料和试剂 除另有说明外，本文件中使用分析纯（含）以上试剂，用水符合GB/T 6682规定的二级水，涉及PCR用水要求达到一级水指标。6.1 试剂 6.1.1 三羟甲基氨基甲烷（C4H11NO3）：纯度99%。6.1.2 乙二胺四乙酸二钠（EDTA2Na）：纯度99.0%。6.1.3 硼酸（H3BO3）：=1.43 g/cm，含量99
6、.5%。6.1.4 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）：=1.32 g/mL，纯度99.0%。6.1.5 氯化钠（NaCl）：=2.165 g/cm，含量99.5%。6.1.6 琼脂糖。6.1.7 Gel-Red 核酸染料。6.1.8 液氮（N2）：=0.81 g/cm。6.1.9 三氯甲烷（CHCl3）：=1.50 g/cm。6.1.10 无水乙醇（CH3CH2OH）：=0.79 g/cm，含量99.7%。6.1.11 DNA 分子量标准（DNA marker）：可以清楚区分 100 bp600 bp 的 DNA 片段。6.1.12 2Taq Plus PCR 预混试剂：0.1 U/L Taq
7、 Plus Polymerase、500 M dNTP each、20 mM Tris-HCl(pH=8.3)、100 mM KCl、3 mM MgCl2、稳定剂、增强剂。6.2 试剂配制 6.2.1 5TBE 缓冲液 称取5.4 g三羟甲基氨基甲烷（6.1.1）、0.372 g乙二胺四乙酸二钠（6.1.2）和2.75 g硼酸（6.1.3）溶于70 mL纯水中，定容至100 mL，在103.4 kPa（121）条件下灭菌20 min。6.2.2 0.5TBE 缓冲液 量取100 mL浓度5TBE缓冲液（6.2.1）于烧杯中，加人900 mL纯水混匀。6.2.3 CTAB 提取溶液 称取4 g十
8、六烷基三甲基溴化铵（6.1.4）、16.38 g氯化钠（6.1.5）、1.21 g三羟甲基氨基甲烷（6.1.1）、1.49 g乙二胺四乙酸二钠（6.1.2）溶于70 mL纯水，定容至200 mL，在103.4 kPa（121）条件下灭菌20 min。6.2.4 无菌纯水 纯水在103.4 kPa（121）条件下灭菌20 min。6.2.5 1%琼脂糖凝胶 DB45/T 21722020 3 称取1 g琼脂糖（6.1.6）溶于100 mL的0.5TBE缓冲液（6.2.2），适当加热融化后加入10 L Gel-Red核酸染料（6.1.7），冷却至60倒入插好梳子的制胶槽中，冷却凝固。7 仪器和设备
9、 7.1 电子天平：精确至 0.1 mg。7.2 恒温水浴锅。7.3 高速冷冻离心机：最高 15 000 rpm。7.4 PCR 扩增仪。7.5 水平电泳系统。7.6 凝胶成像系统。8 引物 正向引物：5-CGCTCTGGTTCATCAACG-3，反向引物：5-TGCTGTCGATGGAAGGTGT-3，预期扩增片段大小为420 bp。9 操作步骤 9.1 样品 采集或送检的甘蔗青叶片做好标识，于-18冰箱中保存备用。9.2 DNA 的提取 取9.1中适量甘蔗叶片用自来水冲洗干净，再用纯水冲洗两遍，自然晾干后用不锈钢剪刀剪碎放入研钵中，加入液氮（6.1.8）研磨成粉末状，分取100 mg放入1
10、.5 mL离心管中，加入750 L CTAB提取溶液（6.2.3），涡旋振荡混匀后于65水浴45 min60 min，期间每隔15 min颠倒离心管混匀；加入500 L的三氯甲烷（6.1.9），颠倒混匀，12 000 rpm 离心3 min，转移上清液约0.5 mL至新离心管中，加入等体积（0.5 mL）约4的无水乙醇（6.1.10），颠倒混匀，于-18冰箱中静置1 h，12 000 rpm 离心3 min，去上清，室温下干燥至乙醇挥发完全；加入50 L无菌纯水（6.2.4）于4条件下保存备用。注：以上为推荐的DNA提取方法。其他能够达到PCR扩增质量要求的DNA提取方法也适用于本文件。9.3
11、 PCR 扩增 9.3.1 PCR 反应体系 PCR反应体系见表1。表1 PCR 反应体系 试剂 终浓度 体积 无菌纯水 -6.5 L 2Taq Plus PCR预混试剂 1 12.5 L 10 mol/L正向引物 1.0 mol/L 2.5 L 10 mol/L反向引物 1.0 mol/L 2.5 L 25 ng/L DNA模板 1.0 ng/L 1.0 L 总体积-25.0 L DB45/T 21722020 4 9.3.2 PCR 反应程序 预变性94，4 min；94变性30 s，55退火30 s，72延伸1 min，35次循环；延伸反应72，10 min。9.3.3 PCR 产物电泳
12、检测 取2.5 L的PCR产物，在1%琼脂糖凝胶（6.2.5）中进行电泳检测，其中一个泳道加入DNA分子量标准(6.1.11)。在电压梯度为1 V/cm5 V/cm条件下电泳，2Taq Plus PCR预混试剂（6.1.12）的蓝色指示带到达胶板2/3处（约40 min）后，可结束电泳。9.3.4 凝胶成像分析 电泳结束后，将1%琼脂糖凝胶（6.2.5）置于凝胶成像仪上成像，根据DNA分子量标准(6.1.11)判定扩增条带的大小。10 结果判定 10.1 有效性判定 以灭菌纯水为空白对照，以感染甘蔗黑穗病病株或病原菌的DNA为阳性对照，以甘蔗无病种苗基因组的DNA提取液为阴性对照。空白对照的扩
13、增产物经电泳检测应无条带出现。阳性对照的扩增产物出现特异性条带，阴性对照的扩增产物经电泳检测均没有预期大小的目的条带。上述空白、阳性、阴性对照同时成立则表明试验有效，否则试验无效。对试验无效，需再次重复试验确认。10.2 阳性判定 如果阳性对照和检测样品中都出现目的扩增条带（420 bp），而阴性对照、空白对照均不出现该条带，该样品判为阳性。10.3 阴性判定 如果阳性对照出现目的扩增条带（420 bp），而阴性对照、空白对照及检测样品中均不出现该条带，则该样品判为阴性。DB45/T 21722020 5 附 录 A（资料性）样品检测电泳图 样品检测电泳图见图A.1。注：MMarker I；空空白对照；阴阴性对照；阳阳性对照；1疑似黑穗病甘蔗叶样品 1；2与样品 1 同株甘蔗青叶样品 2；3疑似黑穗病甘蔗叶样品 3；4与样品 3 同株甘蔗青叶样品 4；5甘蔗青叶样品 5；6甘蔗青叶样品 6；7甘蔗组培苗样品 7；8甘蔗组培苗样品 8。图 A.1 样品检测电泳图 _ 中华人民共和国广西地方标准 甘蔗黑穗病的鉴定方法 PCR 法 DB 45/T 21722020 广西壮族自治区市场监督管理局统一印刷 版权专有 侵权必究
