1、 ICS 11.220 CCS B 41 DB22 吉林省地方标准 DB22/T 33532022 猪冠状病毒检测 重组酶聚合酶扩增（RPA）法 Recombinase polymerase amplification method for the detection of porcine deltacoronavirus 2022-01-28 发布 2022-02-28 实施吉林省市场监督管理厅 发 布 DB22/T 33532022 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1-2020 标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本
2、文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本文件起草单位：吉林农业大学。本文件主要起草人：王开、裴志花、胡桂学、孟凡茹、郭衍冰、邵洪泽、王海军、张德文、赵玉龙。DB22/T 33532022 1 猪冠状病毒检测 重组酶聚合酶扩增(RPA)法 1 范围 本文件规定了猪冠状病毒重组酶聚合酶扩增检测方法的原理、试剂和材料、仪器设备、生物安全、样品、试验步骤和结果判定。本文件适用于猪冠状病毒的实验室检测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版
3、本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 反转录重组酶聚合酶扩增 reverse transcription-recombinase polymerase amplification 一种由重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换Bsu聚合酶参与的恒温扩增技术。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。cDNA 互补脱氧核糖核酸（Complementary Deoxyribonucleic Acid）DEPC 焦碳酸
4、二乙酯（Diethyl Pyrocarbonate）DNA 脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid）MgAc 醋酸镁（Magnesium Acetate）PBS 磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer Solution）RT-RPA 反 转 录 重 组 酶 聚 合 酶 扩 增（Reverse Transcription-recombinase Polymerase Amplification）5 原理 RPA 开始反应后，引物与重组酶组合形成复合物，在模板中寻找同源双链 DNA 进行定位，完成定位后发生链交换反应，形成D-环状结构，使 DNA 结合蛋白与单链DNA链绑
5、定。随后 DNA 聚合酶识别复DB22/T 33532022 2 合物中重组酶解离引物后暴露的 3 端，进行片段扩增，形成两条新的双链DNA，如此循环，从而完成对目的片段的扩增。反应结束后，经琼脂糖凝胶电泳进行结果判定。6 试剂和材料 6.1 试剂 除另有说明，本方法仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合 GB/T 6682 规定的一级水。6.1.1 RPA 扩增所用的引物序列见表 1。表1 引物序列 引物 序列（53）片段大小 PDCoV-RPA-F ATGTGCCTGGTGTTCAGGAGATGCTTTTCGCTGGC PDCoV-RPA-R AGTTGGTTTGGTGGGTGGCTCATAGG
6、TCTGGTTA 185 bp 6.1.2 磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01 mol/L，pH 7.4）。6.1.3 动物组织 RNA 提取试剂盒。6.1.4 反转录试剂盒。6.1.5 重组酶聚合酶扩增试剂盒 Twist Amp Basic RT Kit。6.1.6 DEPC 水。6.1.7 50TAE Buffer。6.1.8 琼脂糖。6.1.9 Marker DL 2 000 bp。6.1.10 阳性对照为人工合成阳性质粒，制备方法见附录 A。6.1.11 阴性对照，DEPC 水。6.2 材料 6.2.1 无菌棉签。6.2.2 钢丝网（300 目）。7 仪器设备 7.1 电子天平，感量 0
7、.01 g。7.2 台式低温高速离心机（4，12 000 r/min）。7.3 移液器（0.5 L10 L、2 L20 L、20 L200 L、200 L1 000 L）。7.4 恒温水浴锅。7.5 高压蒸汽灭菌器。7.6 冰箱，-20。7.7 电泳仪。7.8 垂直板电泳槽。7.9 凝胶成像仪 8 生物安全 DB22/T 33532022 3 8.1 样品采集、样品处理应按 NY/T 541 的规定执行。8.2 实验室操作应按 GB 19489 的规定执行。9 样品 9.1 肠组织 9.1.1 采集肠管组织样品不少于 5 g（7.1）。做好标识，置于密闭容器内，冷冻或 4 冷藏保存和运输。9.
8、1.2 加入样品 10%体积的 PBS（6.1.2）研磨，过 300 目钢丝网（6.2.2），收集滤液，12 000 r/min离心 10 min（7.2），取上清液待检。9.1.3 如不能立即检测，应保存于-20 冰箱（7.6）。9.2 粪便 9.2.1 使用无菌棉签（6.2.1,7.5），采集肛门粪便不少于 5 g，样品采集后冷冻或 4 冷藏保存和运输。9.2.2 加入样品 10%体积的 PBS 研磨，过 300 目钢丝网（6.2.2），收集滤液，12 000 r/min 离心 10 min，取上清液待检。9.2.3 如不能立即检测，应保存于-20 冰箱。10 试验步骤 10.1 RNA
9、提取 按照商品化试剂盒（6.1.3）说明书要求提取相应样品的 RNA。或采用等效方法提取 RNA。10.2 cDNA 合成 按照商品化试剂盒（6.1.4）说明书将 10.1 提取的样品的 RNA 反转录成 cDNA 作为检测模板。10.3 扩增反应体系 猪冠状病毒 RPA 扩增反应（6.1.5）体系见表 2。同时设定阴性、阳性样品对照。表2 猪冠状病毒 RPA 扩增反应体系 试剂 剂量 Rehydration buffer 29.5 L cDNA 模板 2.0 L PDCoV-RPA-F 2.4 L PDCoV-RPA-R 2.4 L DEPC 水（6.1.6）11.2 L MgAc 2.5
10、L 总体积 50.0 L 10.4 反应程序 DB22/T 33532022 4 10.4.1 反应温度 反应体系置于 42 水浴锅中（7.4）。10.4.2 反应时间 反应时间为 25 min。10.4.3 电泳观察 配置电泳液（6.1.7）和1%琼脂糖（6.1.8）凝胶，将阳性（6.1.10）、阴性（6.1.11）和检测样品的扩增产物及 Marker（6.1.9）分别加入凝胶孔（7.3），5 V/min 电泳 30 min（7.7,7.8），再取出凝胶通过凝胶成像仪观察结果（7.9）。11 结果判定 11.1 试验成立条件 阳性对照出现目的 185 bp 扩增条带参见附录 B，阴性对照无目
11、的扩增条带，试验成立。如阳性对照、阴性对照任意一项不满足以上条件，此次试验视为无效。11.2 试验结果判定 11.2.1 阳性结果 被检样品出现 185 bp 条带，判为核酸阳性。11.2.2 阴性结果 被检样品未出现 185 bp 条带时，判为核酸阴性。A DB22/T 33532022 5 A B 附 录 A（规范性）猪冠状病毒重组质粒 A.1 重组质粒 根据PDCoV NH株（GenBank：KU981062）的 N 基因序列，获得阳性克隆的基因序列。A.2 PDCoV阳性质粒的基因序列 Atggctgcaccagtagtccctactactgacgcgtcttggtttcaggtgct
12、caaagctcaaaataaaaaggctactcatcctcagtttcgtggcaatggagttccgcttaactccgccatcaaacccgttgaaaaccatggctactggctgcgttacaccagacaaaagccaggtggtactccgattcctccatcctatgccttttattatactggcacaggtcccagaggaaatcttaagtatggtgaactccctcctaatgacaccccagcaaccactcgtgttacttgggttaagggttcgggagctgacacttctattaagcctcatgttgccaaacgcaaccccaa
13、caatcctaaacatcagctgctacctctccgattcccaaccggagatggcccagctcaaggtttcagagttgaccccttcaacgctagaggaagacctcaggagcgtggaagtggcccaagatctcaatctgttaactccagaggcacaggcaatcagcccaggaaacgcgaccaatctgcacccgctgcggtacgtcgtaagacccaacatcaagctcccaagcggactttacccaagggtaaaaccatttctcaggtatttggcaaccggtctcgcactggtgccaatgtcggctctgc
14、agacactgagaagacgggtatggctgatcctcgcatcatggctctagccagacatgtgcctggtgttcaggagatgcttttcgctggccaccttgagagcaactttcaggcgggggcaattacccttaccttctcttactcaatcacagtcaaggagggttctcctgactatgagagacttaaggatgcgctcaatacggtcgttaaccagacctatgagccacccaccaaaccaactaaggacaagaagcctgacaaacaagaccagtctgctaaacccaaacagcagaagaaacctaa
15、aaaggtaactctgccagcagacaaacaggattgggagtgggatgatgcttttgagataaagcaggaatcagcagcgtag A.3 连接 PDCoV N 基因与 pET-28a 连接（生工合成）。A.4 转化 将感受态细胞E.coli DH5置于冰上，待其融化；在超净工作台中将加入合成质粒 1 L3 L加入100 L感受态细胞，混匀，冰浴 30 min；42 热激1 min2min，冰浴 1 min2 min；加 900 L LB空培养基，摇菌 180 rpm，37，1 h；取摇后培养基 200 L，涂布于含抗生素的固体 LB 培养基，完全吸收后，37 倒置
16、培养 12 h 16 h。A.5 菌落PCR鉴定 PCR反应体系：上/下游引物各 1 L、ddH 2O 8 L、预混 Taq 酶 10 L。PCR反应程序：95，5 min；95，30 s；58，30 s，72，1 min，72，10 min，35 个循环。灭菌牙签取单个菌落与 PCR 体系中搅一下在新板画线，每板挑 10 个菌，新划板 37 倒置培养12 h 16 h。琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物，统计含目标条带菌落号备用。A.6 质粒提取 DB22/T 33532022 6 用 10 L枪头挑取 PCR 检测有目的条带菌落，打入 5 mL 含抗生素液体 LB 培养基的试管中，37，180 rpm,12 h 16 h；取 3 mL5 mL 菌液，室温离心 1000 g，1 min，弃上清。提取步骤参考质粒提取试剂盒；提取质粒-20 保存备用。DB22/T 33532022 7 附 录 B（资料性）电泳图 试验阳性样本和阴性样本的琼脂糖凝胶电泳图见图 B.1。注：MMarker DL 2 000 bp；注：1阴性对照；注：2阳性对照 图 B.1 PDCoV 阳性和阴性琼脂糖凝胶电泳
