1、ICS 11.220 B 41 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 19402013 鸡传染性喉气管炎 PCR 检测技术规程 Technical regulation for detection of Chicken Infectious Laryngotracheitis by PCR 2013-08-28 发布 2013-09-28 实施安徽省质量技术监督局 发 布 DB34/T 19402013 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由安徽省农业委员会提出。本标准起草单位：安徽农业大学动物科技学院、安徽省动物疫病预防与控制中心。本标准主要起草人:
2、王桂军、朱良强、耿照玉、占松鹤、汪彤、江定丰、魏建忠、潘玲、陈静、何长生、杨德康、栗新、吴保谊。DB34/T 19402013 1 鸡传染性喉气管炎 PCR 检测技术规程 1 范围 本标准规定了应用聚合酶链反应（PCR）方法检测鸡传染性喉气管炎，包括样品的采集、样品处理、试验材料、操作程序和结果判定等。本标准适用于临床鸡传染性喉气管炎的检测和诊断。2 试验材料 2.1 特异性引物 根据 ILTV 的 TK 基因序列设计了一对引物，序列为：上游引物 A1：5-GGG AAA CTT GAA TGT CGG GAG-3,下游引物 A2：5-TGG ATT ATA CGC CGT GCC TGT-3
3、，扩增 DNA 片段大小为 329 bp，引物的使用浓度为 50 mmol/L。2.2 试剂 2.2.1 DNA 提取试剂 DNA 提取试剂如下：消化缓冲液：10 mmol/L Tris-Cl，pH 8.0；0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0；10 SDS；20 mg/Ml 蛋白酶 K；苯酚；氯仿；无水乙醇；75乙醇；2.2.2 PCR 试剂 PCR 试剂如下：2Taq PCR MsaterMix 试剂；特异性引物；阳性对照：ILT 活疫苗（含鸡传染性喉气管炎 K317 株病毒）2.2.3 电泳试剂 电泳试剂如下：溴化乙锭；琼脂糖：电泳级；DB34/T 19402013 2 电泳缓冲
4、液 2.2.4 其他试剂 其他试剂如下：灭菌双蒸水；1 mol/L（灭菌）PBS：pH 7.2。2.3 仪器设备及耗材 2.3.1 仪器设备 本方法使用下列仪器设备：PCR 仪；电泳仪；电泳槽；紫外光透射仪；凝胶成像系统；小型高速离心机；水浴锅；旋涡振荡器；乳钵或玻璃研磨器；微量加样器：100 L1000 L、20 L200 L、5 L50 L 和 1 L10 L 等多种规格。2.3.2 一次性耗材 本方法使用下列一次性耗材：离心管（PP 材质）：1.5 mL；PCR 反应管（PP 材质）：0.2 mL；吸头：1 000 L、200 L、10 L 等多种规格。3 操作程序 3.1 喉头、气管组
5、织样品的处理 无菌采取发病鸡的喉头、器官组织样品，置于灭菌乳钵中剪碎，充分研磨，用灭菌 PBS 溶液配成 15 乳悬液,反复冻融 3 次。以 5 000r/min 离心 5 min，收集上清液，供 DNA 提取或置-20保存备用。3.2 待检样品 DNA 提取 3.2.1 喉头、气管组织样品 DNA 提取 取处理好的样品 250 L 于 1.5 mL 离心管中，每管加 400 L 消化缓冲液（500 mmol/L Tris，20 mmol/L EDTA，10 mmol/L NaCl，1 SDS），加蛋白酶 K 至终浓度 100 g/mL，混匀；50水浴 1 h。从水浴中取出消化后样品，每管加入
6、饱和苯酚 600 L，充分震荡摇匀，12000 r/min 离心 10 min；取上清液约 400 L，分别加入 200 L 饱和苯酚和 200 L 氯仿溶液，震荡摇匀，12000 r/min 离心 10 min；取上清液再加入 2.5 倍体积无水乙醇，摇匀后置-20沉淀 30 min；10000 r/min 离心 10 min，DB34/T 19402013 3 弃去上清液，加入 1 mL 75的酒精洗涤沉淀一次，将所得核酸沉淀物放在 42烘箱内烘干或室温放置自然晾干；每管中加入 30 L TE 或灭菌双蒸水。获得的DNA 样品可直接进行 PCR 反应或置-20保存备用。3.3 PCR 检测
7、 在冰浴条件下，按下列试剂用量在 PCR 反应管中分别加入各成分：2PCRTaqMix 酶 12.5 L 50 mmol/LILV 检测上下游引物（A1 和 A2）：各 1 L，终浓度为 1 mmol/L；待检样品 DNA：5 L；灭菌双蒸水：补足至总体积为 25 L。加完试剂后瞬时离心混匀。将 PCR 反应管置于 PCR 仪内，按如下程序进行 PCR 反应：94预变性 3 min 后,进入循环 94变性 15 s,53退火 30 s,72延伸 30 s,30 个循环后,72延伸 10 min。PCR 产物可直接进行琼脂糖凝胶电泳分析或置 4保存备用。3.4 阳性及阴性对照 3.4.1 阳性对
8、照 用 ILT 活疫苗（含鸡传染性喉气管炎 K317 株病毒）作为阳性对照。3.4.2 阴性对照 用灭菌双蒸水作为阴性对照。3.5 电泳 3.5.1 制备 1.0琼脂糖凝胶板。3.5.2 取 5L PCR 产物，与 0.5L 加样缓冲液混合，加入琼脂糖凝胶板的加样孔中。3.5.3 加入分子量标准 DNA Marker。3.5.4 盖好电泳仪，插好电极，将电压调至 90V 左右电泳，3040min。3.5.5 取出凝胶，置于紫外凝胶成像仪系统扫描、拍照。3.5.6 以 DNA Marker 为参照分子量标准，判断 PCR 扩增片段大小。4 结果判定 将电泳后的琼脂糖凝胶置于紫外光透射仪上观察，与标准 DNA 分子量比较，分析结果，然后可用凝胶成像系统拍照保存。若待检样品在 329 bp 左右的位置出现一条特异性 DNA 条带，且与阳性对照的 DNA 条带位置一致，则判定为鸡传染性喉气管炎阳性。A _
