1、DB32/T714-2004前言本标准规定了牛乳中青霉素残留量酶联免疫吸附测定方法，适用于牛乳中青霉素的残留常规快速筛选检测。本标准按GB/T1.1-2000标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则和GB/T1.2-2002标准化工作导则第2部分：标准中规范性技术要素内容的确定方法的规定编写。本标准由扬州大学提出。本标准起草单位：扬州大学兽医学院。本标准起草人：王捍东、卞建春、刘学忠、彭会建、袁燕、唐娜、徐亭、房超。DB32/T714-20044.2.10底物缓冲溶液B,为过氧化氢尿素-柠檬酸溶液。4.2.11终止溶液，为2mol/L硫酸溶液。4.2.12酶标板，为微量反应板，已经以抗体包
2、被和封闭，沿剪切线将铝箔袋剪开，取出所需反应板固定于反应板架上，没有使用的微量反应板与试剂盒提供的干燥剂一并用铝箔袋封好置28冷藏保存。5制样5.1制样宜用新鲜牛乳；若不能立即制样，应贮于不高于4条件，时间不应超过2d。5.2取10mL供试牛乳处理。5.2.1103500g离心10min,弃去上层脂肪层。5.2.2取5mL去脂牛乳，加入0.36mol/L亚铁氰化钾溶液150L,摇匀后再加入1.04mol/L硫酸锌溶液150L,迅速摇匀。5.2.3153500g离心10min。若离心后的上清液仍显混浊，应按5.2.2步骤再次处理。5.2.4取上清液，用缓冲溶液将其作1：1稀释(1份上清液+1份缓
3、冲溶液)，为处理试样，取50L用于测定。6测定步骤6.1将试剂盒取出放置192512h。按每个标准溶液和试样做不少于2个重复测定计算所需酶标板条的数量，插入框架。6.2向微孔中各加入用缓冲液稀释的青霉素-OVA偶联物50L;分别加入青霉素系列标准溶液50L或步骤5.2.4处理试样50L；加入经稀释的抗青霉素特异性抗体50L(空白对照孔不加，以等量缓冲溶液代替)。用封口膜封好，1925瓣育60min。6.3倒掉反应孔的液体，在吸水纸上倒扣酶标板3次，并用吸水纸将酶标板四周吸干，以确保反应孔中不留残余液体；向每孔中加入洗板液，3mi后倒掉孔中液体，重复洗板过程2次。6.4向微孔中加已经稀释的酶标羊
4、抗鼠二抗100L,在微型震荡器上混匀，用封口膜封好，1925孵育30min。倒出孔内液体，按6.3中洗板3次。6.5每孔加50L底物缓冲液A和50uL底物缓冲液B,在微型振荡器上充分混匀（也可先将底物缓冲液A和B等量混匀，每孔加100L),19-25避光孵育15min。6.6每孔加100L终止液，混匀。6.7在酶标读数仪上以450m滤光片，空白对照孔调零，测定其它各孔的吸光度值，30min内完成读数。6.8计算百分吸光度值(%0D)按式1计算：B光0D=X100%(1)Bo式中：B一标准溶液或处理试样孔的平均吸光度值：B。零浓度的标准溶液孔平均吸光度值。以X轴为标准溶液中青霉素浓度(g/L)的自然对数，Y轴为百分吸光度值，在半对数坐标纸上绘制标准曲线图。由标准曲线上查出处理试样中青霉素的浓度(g/L)。或用专业计算机软件求出处理试样中青霉素的浓度。2
