1、ICS 65.020.30CCSB 41DB42湖北省地方标准DB 42/T 15922020鸭坦布苏病毒双抗夹心 ELISA 抗原检测规程Technical procedures of the double antibody sandwich ELISA assays for detection ofduck tembusu virus（报批稿）2020-07-07 发布2020-11-07 实施湖北省市场监督管理局发 布DB42/T XXXX-XXXXI目次前言.II引言.III1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14试剂和材料.15抗体包被板的制备.26待检样品处理.27检测步骤
2、.28废弃物处理和防止污染的措施.2附录 A（资料性）鸭坦布苏病毒单克隆抗体的制备.4附录 B（资料性）对照品的制备.8附录 C（规范性）试剂的配制.10DB42/T XXXX-XXXXII前言本文件按照GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由华中农业大学提出。本文件由湖北省农业农村厅归口。本文件起草单位：华中农业大学、武汉科前生物股份有限公司。本文件主要起草人：金梅林、孙小云、陈伦勇、张雪、孙小美、但汉并、赵联忠、李冉、董晓辉、徐高原。本文件实施应用中的疑问，可咨询湖北省农业农村厅，联系电话：027-87665821，邮箱：；华中农业
3、大学，联系电话：027-87282038，邮箱：。对本文件的有关修改意见建议请反馈至华中农业大学，电话：027-87286905，邮箱：。DB42/T XXXX-XXXXIII引言鸭坦布苏病毒病（Duck Tembusu Virus Disease）是主要引起蛋鸭产蛋量急剧下降的一种疾病，严重的则会出现绝产。该病传播极为迅速，短时间内波及全群，发病率高达100%，死亡淘汰率则根据不同的品种在2%-55%之间。在 2011年召开的第一届水禽疫病防控研讨会期间，中国畜牧兽医学会将该传染病正式统一命名，称为“鸭坦布苏病毒病”。鸭坦布苏病毒病的疾病传播特点和危害使得病原的监测和检测成为各地疫控部门和各
4、个规模化养殖场的重要工作之一。DB42/T XXXX-XXXX1鸭坦布苏病毒双抗夹心 ELISA 抗原检测规程1范围本文件规定了鸭坦布苏病毒双抗夹心ELISA抗原检测的术语和定义、试剂和材料、抗体包被板的制备、待检样品处理、检测步骤、废弃物处理和防止污染的措施。本文件适用于鸭坦布苏病毒病原的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682-2008分析实验室用水规格和试验方法。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.
5、1鸭坦布苏病毒Tembusu virus鸭坦布苏病毒是一种急性传染病，以蛋鸭、种鸭产蛋骤然下降为主要临床特征、以出血性卵巢炎为主要病变特征。3.2酶联免疫吸附法Enzyme-linked immune sorbent assay酶联免疫吸附法是将抗原抗体反应的高度特异性与酶标记技术相结合，将已知的抗原或抗体标记上酶示踪物质，利用酶对底物的高效催化作用，通过酶标仪测定酶分解底物产生的有色物质的光密度值，计算抗原或抗体的含量。3.3630nm 吸光度值Optical density at 630nmOD 值表示被检测物吸收掉的光密度，是检测方法里的专有名词，检测单位用 OD 值表示，OD=lg(1
6、/trans)，其中 trans 为检测物的透光值,因此又叫通光率。630nm 吸光度值即为在 630nm 的波长下测 OD 值。4试剂和材料4.1试剂鸭坦布苏病毒单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记鸭坦布苏病毒单克隆抗体、TMB 底物显色液、终止液、阳性对照品、阴性对照品、样品稀释液、20 倍浓缩洗涤液、碳酸盐包被液、封闭液。鸭坦布苏病毒单克隆抗体制备、纯化及HRP标记鸭坦布苏病毒单克隆抗体制备方法见附录A。DB42/T XXXX-XXXX2阳性对照品、阴性对照品的制备方法见附录B。试剂配方见附录C。4.2仪器设备及耗材离心机（12000rpm）、恒温箱（37）、聚苯乙烯微量反应板（96 孔）、酶
7、标仪（630nm 波长）、多道移液器（300L）、单道移液器（100L、1mL）。5抗体包被板的制备5.1鸭坦布苏病毒单克隆抗体的包被将纯化的鸭坦布苏病毒单克隆抗体用碳酸盐包被液稀释至5.98ng/L，每孔加100L，置于28冰箱静置12h15h。5.2包被板的封闭弃净包被板中所有的液体，每孔加入封闭液200L，置于37恒温箱静置2h；再次弃净包被板中所有的液体，将包被板静置于37恒温箱2h。6待检样品处理6.1拭子样品的处理在装有拭子的离心管中，加入500L样品稀释液，充分振荡涡旋后，10000rpm离心3min，弃沉淀，取100L上清进行检测。6.2组织样品的处理每份组织样品取1g，加入2
8、mL样品稀释液，研磨匀浆，12000rpm离心2min，取上清，再次12000rpm离心3min，取100L上清进行检测。7检测步骤7.1取制备好的抗体包被板，用洗涤液洗涤 3 次，弃净孔中液体，将处理好的待检样品、阴性对照和阳性对照各取 100L 加至抗体包被板中，阴、阳性对照各设 2 孔，置 37恒温箱中下温育 60min。7.2弃去孔中液体，每孔加入洗涤液 300L/孔，重复洗涤 5 次。7.3将辣根过氧化物酶标记的鸭坦布苏病毒单克隆抗体用封闭液稀释到工作浓度，100L/孔，置 37恒温箱中温育 60min。7.4重复步骤 7.2。7.5每个反应孔中加入底物显色液 100L，置 2025
9、恒温箱中避光显色 10min。7.6每孔加入终止液 50L。7.7用酶标仪在波长 630nm 处测定各孔的 OD 值。7.8检验结果的判定，当 S（样品 OD630nm）/N（阴性对照 OD630nm）2，阴性对照 OD630nm0.25 时试验成立，样品检测结果判为阳性；当 S（样品 OD630nm）/N（阴性对照 OD630nm）2，阴性对照 OD630nm0.25 时，样品检测结果判为阴性。DB42/T XXXX-XXXX38废弃物处理和防止污染的措施8.1试验完毕，酶标板，移液器吸头，样品处理时使用过的离心管等耗材须高温高压灭菌处理。8.2试验过程中丢弃的废液须加入 84 消毒液或新洁
10、尔灭彻底消毒。DB42/T XXXX-XXXX4附录A（资料性）鸭坦布苏病毒单克隆抗体的制备A.1鸭坦布苏病毒单克隆抗体的制备A.1.1免疫小鼠用超离纯化灭活的鸭坦布苏全病毒免疫6周龄-8周龄雌性BALB/c小鼠，免疫剂量为100ng/只。取适量的纯化病毒溶液用PBS稀释后加入等体积的弗氏完全佐剂充分乳化后颈背部皮下多点接种，每只接种200L。首免两周后再次免疫，剂量同于首次，与弗氏不完全佐剂体积比1:1充分乳化后接种，两周后再次进行三免，免疫剂量及佐剂的选择同于第二次免疫，三免后一周尾静脉采全血5L，溶于200L PBS中，混匀，依次倍比稀释加入到用纯化的DTMUV全病毒液包被的酶标板中测定
11、小鼠的血清抗体效价，取效价最高的小鼠，加强免疫，免疫剂量为100ng，不加佐剂，直接腹腔注射，72h后进行融合试验。A.1.2饲养脾细胞及免疫脾细胞的制备取饲养小鼠及免疫小鼠，分别摘眼球采血，分离血清作为阴/阳性血清备用。拉颈致死后浸于75%酒精浸泡10min。将小鼠腹部向上右侧位卧放，用消毒的注射器针头固定其四肢。小心打开其腹腔，无菌取出脾脏，置于研磨器中加10mL RPMI 1640溶液研磨，静置2-3min后吸出上清于无菌50mL EP管内，再加入10mL1640研磨静置2min后取上清加入无菌EP管内，将上清1000rpm离心10min，去除上清获得饲养脾细胞和免疫脾细胞。在饲养细胞中
12、加入50mL HAT溶液，轻轻混匀，置于37温箱。在免疫脾细胞中加入50mL RPMI1640溶液，轻轻混匀。将瘤细胞上清弃去，将免疫脾细胞溶液加入其中，轻轻混匀，1000rpm，离心10min，去除上清。A.1.3融合试验轻轻用手指叩击装有免疫脾细胞及SP2/O细胞的EP管底，使混合细胞松动，将EP管浸入37温水中，用巴氏管吸取预热的PEG1450溶液1mL，边轻轻搅动细胞边滴加溶液，1min内匀速加完，继续搅30s，静置30s后边搅拌边加入预热的1640溶液，8min内加入40mL 1640以终止反应。1000rpm10min，去除上清，加入50mL预热的HAT溶液，轻轻混匀。取一个无菌试
13、剂瓶，将饲养细胞和融合细胞加入混匀，分铺于96孔板中，每孔100L，每孔再补加一滴完全培养基，将细胞板置于37 CO2培养箱中静置培养。每天观察杂交瘤细胞的生长情况，在融合后第5天用HAT培养基进行半换液，第10天用HT培养基将HAT培养液全部换出，待杂交瘤细胞长至孔底的1/31/2时，取100L细胞上清进行检测。A.1.4阳性杂交瘤细胞的筛选A.1.4.1间接ELISA检测方法的确定用方阵法确定包被原和血清的工作浓度。取超离纯化的DTMUV全病毒液作为抗原，用碳酸盐包被液按1:50稀释，按每孔100L添加到96孔酶标板第一列中，提前在每孔内加入100L包被液，从第一列取100L稀释的抗原加入
14、到第二列，混匀后DB42/T XXXX-XXXX5再取100L至第三列，依次倍比稀释至1:204800，同时按同样的方式包被两块酶标板，置4过夜。次日将包被好的酶标板用PBS-T洗涤，每孔加入120L白保护剂BSA封闭溶液，37孵育2h，进行封闭。再次洗涤拍干。将分离保存的免疫小鼠和饲养小鼠的血清分别作为阳性和阴性血清，用PBS按1:50倍稀释，第一行每孔加入200L，余孔提前加入100LPBS，从第一行取100L到第二行开始倍比稀释至1:6400，37度孵育1h，洗板后加入1:5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37孵育1h，洗板后加入TMB底物显色液，10min-15min后加入2mo
15、l/L稀H2SO4溶液终止反应。读取OD630nm数值。按照P/N值最大原则，确定病毒液的最佳包被浓度。A.1.4.2阳性杂交瘤细胞的筛选按方阵法确定的抗原包被浓度包被一批酶标板，封闭处理后4度保存。取融合细胞上清100L按标记好的顺序加入到病毒和空白辅筛酶标板中，按间接ELISA方法进行检测，同时用1.2中饲养小鼠和免疫小鼠的血清分别作阴阳性对照。A.1.4.3阳性杂交瘤细胞的克隆将通过检测初步确定为阳性的杂交瘤细胞采用倍比稀释法进行亚克隆。轻轻吹落96孔内细胞，取100L至提前加有100L完全培养基的细胞板孔内，混匀，吸取100L到第二个加有100L完全培养基的细胞板孔内，依次倍比稀释到第
16、八个孔。在显微镜下观察，将约有100个细胞的孔内细胞再次吸出用完全培养液稀释至10mL，分铺于一块提前铺好饲养细胞的96孔板内，每孔100L，37 CO2培养箱内静置培养，此过程称之为亚克隆。将倍比稀释最后一孔多出的100L及96孔板剩余的细胞移取至加有饲养细胞的24孔板内进行扩大培养。亚克隆细胞培养至5天左右进行半换液，7天左右进行全换液，取上清进行检测，对检测为阳性的细胞按上述方法再次进行亚克隆及检测。对连续三次亚克检测为阳性的单克隆细胞进行定株，同时将扩大培养的原代细胞及时冻存。A.1.4.4阳性杂交瘤细胞腹水的制备将亚克隆经过检测定株的杂交瘤细胞复苏，扩大培养。提前一周用弗氏不完全佐剂腹腔注射8周龄BALB/c小鼠，0.5mL/只，将扩大培养处于对数生长期的杂交瘤细胞离心，去掉培养基，用RPMI1640不完全培养基重悬后腹腔注射小鼠。待小鼠腹部隆起时，抽取其腹水，离心，去除沉淀，上清冻存待用。A.2单克隆抗体纯化及验证A.2.1单克隆抗体纯化将保存的单抗腹水6mL置于pH7.4 PBS溶液中透析过夜，次日取出，加入6mL PBS混匀。将ProteinA胶吸至纯化柱内，将柱子垂直
