1、ICS 65.020.30 B 43 DB14 山西省地方标准 DB 14/T 15182017 晋汾白猪种质分子鉴定 SSR 标记法 2017-12-10 发布 2018-02-10 实施 山西省质量技术监督局 发 布 DB14/T 15182017 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 原理.2 5 试验准备.2 6 步骤.2 7 判定依据.3 8 结果表述.3 附录 A（规范性附录）溶液配制说明.4 附录 B（资料性附录）FAO-ISAG 推荐引物信息表.7 附录 C（资料性附录）样品 DNA 的制备及质控检测.8 附录 D（资料性附录）PCR
2、 反应体系及程序.10 附录 E（资料性附录）扩增产物的银染检测方法.11 附录 F（资料性附录）数据分析指标及公式.13 DB14/T 15182017 II 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由山西农业大学提出并归口。本标准起草单位：山西农业大学、中国农业大学、大同市种猪场、山西省畜禽繁育工作站、山西天合元动物保健科技有限公司。本标准主要起草人：高鹏飞、郭晓红、曹果清、李步高、刘剑锋、杨连仲、王效京、刘宏、孙秉耀、石建中、赵万军。DB14/T 15182017 1 晋汾白猪种质分子鉴定 SSR 标记法 1 范围 本标准规定了利用SSR标记法进行晋汾白猪品种鉴
3、定的原理、试验准备、步骤、判定依据和结果表述。本标准适用于晋汾白猪种质分子鉴定。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 NY/T 1673 畜禽微卫星DNA遗传多样性检测技术规程 SN/T 2123 出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范。DB14/T 1300 晋汾白猪 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 SSR 标记 SSR标记，即简单重复序列（Simple Sequence R
4、epeats,SSR），又称微卫星DNA，由核心序列和两侧的侧翼序列组成，侧翼序列使微卫星特异地定位于染色体上，核心序列重复数的差异形成微卫星高度的多态性。3.2 参照样品 对应于SSR位点不同等位基因的一组样品。3.3 位点 对应于SSR位点不同等位基因的一组样品。3.4 核心位点 DB14/T 15182017 2 DNA分子标记法鉴定品种时优先选用的一组位点，具有多态性高、稳定性强、重复性好、分布均匀等特点。3.5 扩展位点 DNA分子标记法鉴定品种时备选的一组位点，具有重复性好，分布均匀的特点。4 原理 根据SSR侧翼序列设计一对特异引物，利用PCR技术扩增目的片段，由于不同个体SSR
5、重复数不等，电泳后不同长度的PCR产物得以分离，经硝酸银染色加以区分。5 试验准备 5.1 实验仪器设备 凝胶成像系统、PCR仪、低温高速离心机、紫外分光光度计、稳压温流电泳仪、高压灭菌器、单道可调移液器(2 l，10 l，20 l，100 l，200 l，1000 l)、微量电子天平、水浴恒温震荡器、电泳槽、普通离心机、紫外检测仪、超纯水仪。5.2 试验所用试剂 血液裂解液、组织DNA提取液和精子裂解液、饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、溴化乙锭、10 TBE或TAE电泳缓冲液、6 上样缓冲液、100 bp DNA分子量标记、冰乙酸、琼脂糖、RNA酶、蛋白酶K、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过
6、硫酸铵、硝酸银、N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED）、无水碳酸钠、dNTPs、Tap DNA聚合酶、超纯水。5.3 溶液配置 溶液配置方法见附录A，除另外说明外，附录A中仅使用确认为分析纯的试剂。6 步骤 6.1 样品采集 6.1.1 对于动物样品的采集与保存按照 SN/T 2123 的规定执行。6.1.2 采集个体应具备晋汾白猪品种的典型特征，符合 DB14/T 1300 的要求，采集三代内无血缘关系的个体不少于 30 头，其中雌性数量不少于 1/3。6.1.3 样品采集时应详细记录材料名称、来源、系谱、采集地点和时间、样品保存条件。6.2 样品 DNA 提取 样品DNA的制备方法参见
7、附录B。6.3 引物合成 DB14/T 15182017 3 使用联合国粮农组织(FAO)和国际动物遗传学会(ISAG)推荐的用于畜禽微卫星DNA遗传检测的标记30对，引物序列参见附录C。引物合成委托生物公司合成。6.4 DNA 微卫星位点的扩增及检测 6.4.1 采用 PCR 方法扩增所选微卫星引物的目的片段。6.4.2 PCR 反应体系及程序参见附录 D。6.4.3 扩增产物的检测方法参见附录 E。6.5 基因分型 6.5.1 利用凝胶成像分析系统进行分析，根据分子量标记物的大小标定检测片段的大小。6.5.2 扩增片段要求条带清晰；纯合子为一条带，杂合子为两条带，且两条带着色深浅基本一致。
8、6.5.3 根据片段大小确定等位基因型。6.6 数据统计分析 6.6.1 数据统计分析等位基因频率、哈代-温伯格平衡、遗传杂合度、多态信息含量、基因分化系数、Nei 氏遗传距离，具体算法公式参见附录 F。6.6.2 应用 GENEPOP 软件进行数据分析并进行聚类分析，采用 Bootstrap 检验可检验所得系统发生树的可靠性。7 判定依据 7.1 品种间差异位点数3，判定为不同品种。7.2 品种间差异位点数=2 或 1，判定为近似品种。7.3 品种间差异位点数=0，判定为疑同品种。7.4 对 7.1 和 7.2 的结果，结合表型检测数据进行综合判定。8 结果表述 检测位点数为 ，差异位点数为
9、 ，判定为遗传相似度为 ，位点缺失率为 ，判定为 （相同或相近、不同）。DB14/T 15182017 4 附 录 A （规范性附录）溶液配制说明 A.1 DNA提取试剂的配制 A.1.1 血液裂解液 血液裂解液配制见表A.1。表A.1 血液裂解液的配制 贮存液浓度 体积(mL)使用浓度 1 mol/L Tris-HCL（pH8.0）1 10 mmol/L 0.5 mol/L EDTA（pH8.0）20 100 mmol/L 10%SDS 20 2%灭菌双蒸水加至 100 A.1.2 组织DNA提取液 组织DNA提取液配制见表A.2。表A.2 组织 DNA 提取液的配制 贮存液浓度 体积（mL
10、）使用浓度 1 mol/L Tris-HCL（pH8.0）5 50 mmol/L 0.5 mol/L EDTA（pH8.0）20 100 mmol/L 0.5 mol/L NaCl 20 100 mmol/L 10%SDS 20 2%灭菌双蒸水加至 100 A.1.3 精子裂解液 精子裂解液配制见表A.3。表A.3 精子裂解液的配制 贮存液浓度 体积(mL)使用浓度 1 mol/L Tris-HCL（pH8.0）1 10 mmol/L 0.5 mol/L EDTA（pH8.0）2 10 mmol/L 0.5 mol/L NaCl 20 100 mmol/L 10%SDS 20 2%1 mol/
11、L DDT（现用现加）0.0039 39 mol/L 灭菌双蒸水加至 100 A.1.4 精子洗涤液 DB14/T 15182017 5 取1 mol/L NaCl 37.5 mL，0.5 mol/L的EDTA 5 mL，加双蒸水至250 mL。高压灭菌备用。A.1.5 0.5molLEDTA溶液 1.86.1 g EDTA-Na2 2H2O溶于800 ml水中，用1 molL NaOH调PH至8.0，定容至1 000 mL，在103.4 kPa灭菌。A.1.6 1 molL Tris-HCL溶液 60.55 g Tris-base溶于适量水中，加1 molL HCL调PH至8.0，定容至50
12、0 mL，103.4 kPa灭菌。A.1.7 0.5 molL HCL溶液 25 mL浓盐酸（36%38%），加水定容至500 mL。A.1.8 氯仿-异戊醇（24:1）按24:1 的比例（体积比）配制混合液。A.1.9 TE缓冲液 1 molL Tris-HCL 5 mL，0.5 molL EDTA 1 mL，加HCL调pH至8.0，定容至500 mL。A.1.10 蛋白酶K贮存液（20 mg/mL）200 mg蛋白酶K溶于10 mL灭菌双蒸水中，分装，每管1 mL,-20 冻存。A.2 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂的配制 A.2.1 30%丙烯酰胺（丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺=29：1）200
13、 mL水中溶解285 g丙烯酰胺，15 g甲叉双丙烯酰胺，定容至1 L，4 保存。A.2.2 6%PAGE胶 尿素450 g，10 xBTE缓冲液100 mL，40%PAGE胶150 mL，定容至1 000 mL。A.2.3 10%过硫酸铵溶液 8 mL水中溶解1 g过硫酸铵，加水至10 mL 4 保存。A.2.4 10 xTBE缓冲液 Tris-base 108 g，硼酸55 g，EDTA-Na2 2H2O 7.44 g，定容至1 L。A.2.5 1xTBE缓冲液 10 xTBE缓冲液500 mL，定容至5 L。A.2.6 6x加样缓冲液 去离子甲酰胺（用于DNA变形）49 mL，0.5 m
14、molL EDTA 1 mL，溴酚蓝0.125 g，二甲苯青0.125 g。A.3 银染试剂的配制 DB14/T 15182017 6 A.3.1 固定液 200 mL冰醋酸，加水定容至2 000 mL。A.3.2 染色液 3 g硝酸银，加水定容至2 000 mL。A.3.3 显影液 2 000 mL，蒸馏水中加入25 g氢氧化钠和7 mL甲醛。注：银染溶液的配制可使用符合GBT 6682规定的三级水。DB14/T 15182017 7 A B 附 录 B （资料性附录）FAO-ISAG 推荐引物信息表 B.1 DNA样品的制备方法 B.1.1 血液DNA的制备 B.1.1.1 取适量血液加入
15、等体积血液样品裂解液，加入RNA酶至终浓度为20 g/mL，充分混匀，37 消化2 h。B.1.1.2 加入蛋白酶K至终浓度100 g/mL，混匀，55 水浴消化12 h。B.1.1.3 加入等体积Tris饱和酚，反复颠倒混匀，4 12 000 r/min离心15 min；吸取上清液转移至另一离心管中。B.1.1.4 加入等体积苯酚：氯仿那个：异戊醇（25：24：1）混合液，缓慢颠倒离心管使溶液充分混匀，4 12 000 r/min离心15 min，吸取上清液至另一离心管中。B.1.1.5 加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，轻轻颠倒离心管至白色絮状物DNA沉淀出现，冰浴20 min，4 12 0
16、00 r/min离心15 min。B.1.1.6 弃去上清液，加入75%乙醇1 mL洗涤沉淀。B.1.1.7 等待DNA干燥后，加入适量TE缓冲液溶解。B.1.2 组织DNA的制备 B.1.2.1 取0.1 g左右组织于1.5 mL离心管中，用眼科手术剪剪碎。B.1.2.2 加入500 L组织DNA提取液，同时加入RNA酶至终浓度为20 g/mL充分混匀，37 消化2 h。B.1.2.3 加入蛋白酶K至终浓度150 g/mL，混匀，55 水浴消化12 h。B.1.2.4 以下步骤同A.1.1.3A.1.1.7。B.1.3 毛发DNA的提取 B.1.3.1 用灭菌水洗涤毛发，置于1.5 mL离心管中，剪碎。B.1.3.2 加入50 L组织DNA裂解液，同时加入RNA酶至终浓度为20 g/mL充分混匀，37 消化至毛发完全溶解。B.1.3.3 以下步骤同A.1.1.2A.1.1.7。B.1.4 精液DNA的提取 B.1.4.1 取冻精2支或新鲜精液0.5 mL，置于1.5 mL离心管中。B.1.4.2 加入等量精液洗涤液，4 500 r/min离心6 min，弃去上清液，重复洗涤2次。B.
