1、 ICS 11.CCS B 4广牛传Detect2021-220 41 西壮传染性tion of i-04-25 发壮族性鼻气nfectiou发布 广西壮族自气管炎酶us bovinec壮族自治区自治 炎病毒酶链反e rhinotrchain rea 区市场监督区毒的检反应法racheitiaction 督管理局 地DB检测 s virus 发 布 45方标B45/T 23巢式Nested p2021-0布 5 标准112021 式聚合polymera05-31 实准 合ase 实施DB45/T 23112021 II 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文
2、件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内家可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由广西壮族自治区农业农村厅提出并宣贯。本文件由广西畜牧业标准化技术委员会归口。本文件起草单位：广西壮族自治区兽医研究所。本文件主要起草人：范晴、张民秀、王盛、李小凤、李丹、万丽军、阮志华、任红玉。DB45/T 23112021 1 牛传染性鼻气管炎病毒的检测 巢式聚合酶链反应法 1 范围 本文件规定了巢式聚合酶链反应法检测牛传染性鼻气管炎病毒的材料准备、操作方法及结果判定。本文件适用于广西行政区域内牛传染性鼻气管炎病毒的检测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构
3、成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 31190 实验室废弃化学品收集技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 牛传染性鼻气管炎病毒 infectious bovine rhinotracheitis virus 属疱疹病毒科，水痘病毒属，基因组为双链DNA。3.2 聚合酶链反应 polymerase chain reaction 简称PCR技术，是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。3.3 巢式 PCR 反应 nested polymerase
4、 chain reaction 简称Nested PCR，PCR技术的一种特殊形式，在常规PCR扩增的片断内再设计一对新的引物，对常规PCR的产物进行二次PCR扩增，扩增出比常规PCR更短的产物，可显著提高其检测的敏感度。3.4 引物 primers 与待扩增DNA片段两侧互补的一小段寡核苷酸。3.5 外套引物 outer primers 用于第一次PCR的引物。3.6 内套引物 inner primers 用于第二次PCR的引物。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。IBRV：牛传染性鼻气管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus）DB45/T 2
5、3112021 2 PCR：聚合酶链反应（polymerase chain reaction）5 材料准备 5.1 IBRV 特异性引物 引物序列见附录A中的A.1.1。外套引物F1和F2扩增的目的片段为416 bp，内套引物F3和F4扩增的目的片段为334 bp，引物使用浓度均为50 pmol/L，置于-20 保存。5.2 试剂 5.2.1 DNA 抽提试剂 如下：Trizol DNA 抽提试剂1)(或其它等效抽提剂)；氯仿；异丙醇；75乙醇；100乙醇；0.1 mol/L 柠檬酸钠乙醇；8 mmol/L NaOH。5.2.2 PCR 试剂盒 如下：Taq DNA 聚合酶；dNTPs 混合物
6、：包括 dATP、dTTP、dCTP、dGTP；10 倍 PCR 缓冲液（含 Mg2+）。注：试剂盒包含了PCR扩增所必需的各种酶、dNTPs及Mg2+等全部试剂。5.2.3 电泳试剂 如下：1琼脂糖；10 g/mL 核酸染料；加样缓冲液；1 倍 TAE 电泳缓冲液。5.2.4 其它试剂 如下：灭菌双蒸水；磷酸盐缓冲液（PBS pH7.2)。1)Trizol DNA 抽提试剂（商品名）是由 Invitrogen 公司（供应商）提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其它等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。DB45/T 23112021 3
7、 5.2.5 试剂配置方法 见附录B。5.3 仪器设备和一次性耗材 5.3.1 仪器设备 如下：PCR 仪；电泳仪；紫外检测仪；凝胶成像系统；小型高速离心机；旋涡振荡器；研钵或玻璃研磨器；微量加样器；超净工作台。5.3.2 一次性耗材 如下：手套；离心管；PCR 反应管；吸头。6 操作方法 6.1 样品准备 6.1.1 样品采集和预处理 6.1.1.1 口鼻分泌物 用棉拭子取待检牛的口鼻分泌物，经无菌PBS洗脱，650 g离心10 min,取上清250 L供总DNA抽提。6.1.1.2 血液 常规采集待检牛血液0.5 mL1 mL，立即按8:1比例加入4柠檬酸三钠抗凝剂，混合均匀，650 g离
8、心5 min，除去血浆,用PBS在相同离心力下，离心洗涤血细胞3次，除去上清液，用250 L无菌PBS重新悬浮血细胞，供总DNA抽提。6.1.1.3 病料组织 取组织样品如小肠、脾脏、肠系膜淋巴结等1 g，置于研钵或玻璃研磨器中，加入4 mL无菌PBS充分研磨，收集组织悬液，反复冻融3次。650 g离心5 min，取上清液250 L供总DNA抽提。6.1.2 病毒分离培养物收获及处理 收获疑感染 IBRV、产生病变的单层细胞培养物，反复冻融 3 次。以 650 g 离心 5 min，收集上清液，DB45/T 23112021 4 供总 DNA 抽提。6.2 待检样品总 DNA 抽提 在经预处理
9、的250 L待检样品中加入TrizolDNA抽提试剂750 L，混合均匀，室温作用10 min，继续加入 200 L 氯仿，振荡混匀，室温放置 15 min，于 4 下 7 200 g 离心 10 min，弃上层液体，收集中间层和氯仿层液体，加入 100乙醇 300 L，颠倒混合均匀，室温放置 10 min，于 4 下 5 000 g离心 10 min，弃上清液，加入 0.1 mol/L 柠檬酸钠乙醇 1 mL，室温放置 30 min，于 4 下 5 000 g 离心5 min，再弃上清液，此步骤重复 3 次,加入 75乙醇 2 mL,室温作用 10 min,于 4 下 5 000 g 离心
10、5 min，弃上清液,将离心管倒置于超净工作台内风干 10 min,最后加入 8 mmol/L NaOH 重悬总 DNA 100 L,抽提好的 DNA 置于-20 保存。6.3 Nested PCR 检测 6.3.1 检测操作 6.3.1.1 外套 PCR 操作 在冰浴条件下，按如下用量分别加入各试剂：10 倍 PCR 缓冲液（含 Mg2+），2.5 L；5 U/L Taq DNA 聚合酶，0.5 L；IBRV 外套引物 F1 和 F2(各 50 pmol/L），各 1 L；DNA，2 L；灭菌双蒸水，补足至总体积为 25 L。6.3.1.2 外套 PCR 反应程序 添加试剂后离心混合，将 P
11、CR 反应管置于 PCR 仪内，按以下程序进行反应：a)94 预变性 5 min；b)94 变性 30 s；c)55 退火 30 s；d)72 延伸 30 s 的循环，共循环 35 次，最后一次 72 延伸 10 min，结束扩增；a)PCR 产物电泳或置于 4 保存。6.3.1.3 内套 PCR 操作 夺外套PCR反应结束后，在冰浴条件下，按如下用量分别加入各试剂：10 倍 PCR 缓冲液（含 Mg2+），2.5 L；5 U/L Taq DNA 聚合酶，0.5 L；IBRV 内套引物 F3 和 F4(各 50 pmol/L），各 1 L；外套 PCR 产物，2 L；灭菌双蒸水，补足至总体积为
12、 25 L。6.3.1.4 内套 PCR 反应程序 添加试剂后离心混合，将 PCR 反应管置于 PCR 仪内，按以下程序进行反应：a)94 预变性 5 min；b)94 变性 30 s；c)55 退火 30 s；DB45/T 23112021 5 d)72 延伸 30 s 的循环，共循环 35 次，最后一次 72 延伸 10 min，结束扩增；e)PCR 产物电泳或置于 4 保存。6.3.2 Nested PCR 空白对照及阳性对照 6.3.2.1 空白对照 用2 L灭菌双蒸水代替总DNA为模板作空白对照。6.3.2.2 阳性对照 用含有IBRV结构蛋白gB基因的质粒2 L为模板作阳性对照。6
13、.4 电泳 6.4.1 将凝胶托架水平放置于工作台上，在卡槽内放上梳子。6.4.2 称取 1.0 g 琼脂糖于三角瓶中，加入 1 倍 TAE 电泳缓冲液 100 mL，微波炉加热溶解琼脂糖完全溶解至清亮无颗粒状，待凝胶液冷至 50 时，加入 5 L 核酸染料 10 mg/mL，充分混合，完成凝胶配制。6.4.3 将凝胶液沿托架边缘缓慢连续注入，使凝胶液自由流向各方，凝胶厚度为 3 mm5 mm。待凝胶完全凝固后，将托架放入电泳槽中，加入 1 倍 TAE 电泳缓冲液，使之没过胶面 2 mm，拔出梳子。6.4.4 将 7 LIBRV 内套 PCR 产物与 3 L 加样缓冲液混合均匀，加至琼脂糖凝胶
14、样品孔中，同时设置100 bp 标准 DNA 分子量对照。以 5 V/cm 稳压电泳，直至溴酚蓝指示剂到达离琼脂糖凝胶末端 2 cm3 cm 时停止。7 结果判定 7.1.1 将电泳后的琼脂糖凝胶置于紫外检测仪上或凝胶成像系统上观察，与 DNA 分子质量标准物比较，分析结果，然后用凝胶成像系统拍照保存。当阳性对照在 334 bp 位置处出现 DNA 扩增带，空白样品未出现目的扩增带时，试验结果成立。7.1.2 若被检样品在 334 bp 位置处出现 DNA 扩增带，判定为 IBRV 阳性，记为（+）。7.1.3 若被检样品在 334 bp 位置处未出现 DNA 扩增带，判定为 IBRV 阴性，
15、记为（-）。7.1.4 检测结果凝胶电泳图见附录 A 中的图 A.1。DB45/T 2316 A.1 IBRV 特A.1.1 IBR外套引A.1.2 扩增IBRV基A.1.3 扩增为334 bA.1.3.1 N见图A.标引序号112阳3阴4检12021 特异性引物序RV特异性引物物F1和F2，F1：5A F2：5G F3：5T F4：5C增目的基因 基因组的结构增目的片断大bp。Nested PCR 检1。号说明：100 bp标准DN阳性对照（+阴性对照（-检测样品IBR序列及扩增目物序列 内套引物F3和ACG GAC GATGCC GTG AAGTCT GTG AACCGT CTC GCA蛋
16、白gB基因大小 检测结果电泳NA分子量对照+），334 bp为-）；RV阳性（+）图附引物序列及目的基因 和F4，如下：T GTG TAC AG CGG AAG TC TGC ATC GA GCA TTT C。泳图示例 照；为扩增的目的。图A.1 NesteA A 附录A （规范性）及检测结果判：ACG G3；TTC C3 GTG GA3CGT3。的基因片断大ed PCR 检测判断图示 ；大小；测结果电泳图 B.1 0.将2B.2 8 m将无B.3 加B.3.1 B.3.2 膜过滤除B.4 TAB.4.1 B.4.1.1B.4.1.2醋酸，充B.4.2 所需B.5 废每 1过滤溶液1 mol/L 柠檬.58 g柠檬酸mmol/L NaOH无水NaOH 0.0样缓冲液 所需试剂如下 蔗糖 40 0.5 mol 10SDS 溴酚蓝 双蒸水将蔗糖完全溶除菌，4 保AE 电泳缓冲液50倍TAE电泳 所需试剂如 Tris：2 EDTA H2O 向烧杯中依充分搅拌，加1倍TAE电流缓需试剂如下：50 倍 TA 双蒸水弃物处理 1 000 mL 废弃液，过滤后的檬酸钠乙醇 酸钠乙醇完全H 04 g完
