1、ICS 11.220 B 41 DB21 辽宁省地方标准 DB21/T 24682015 新城疫免疫抗体监测技术规范 Technical specification for monitoring immune antibody of Newcastle disease 2015-04-30 发布 2015-06-30 实施 辽宁省质量技术监督局 发 布 DB21/T 24682015 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。本标准主要起
2、草人：王宏燕、赵晓彤、薛树山、闫海滨、马建山、石霖、李清竹、吴运谱、何欣、王志国、赵鹏、李晓楠。DB21/T 24682015 1 新城疫免疫抗体监测技术规范 1 范围 本标准规定了新城疫免疫抗体监测技术中的样品采集和制备、血凝试验、血凝抑制试验的操作规程和综合判定。本标准适用于新城疫疫苗免疫抗体监测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 16550-2008 新城疫诊断技术 3 缩略语 下列缩略语适用于本标准。HA：血凝（hemagglutin
3、ation）HAU：血凝单位（hemagglutination unit）HI：血凝抑制（hemagglutination inhibition）4 器材与试剂 4.1 器材：普通天平、分析天平、普通离心机、微型振荡器、冰箱、高压灭菌器、微量移液器、滴头、96 孔 90 度 V 形血凝反应板。4.2 阿氏液(Alsevers Solution)：配制方法参见附录 A 中 A.1。4.3 pH7.2 0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）：配制方法参见附录 A 中 A.2。4.4 1%鸡红细胞悬液：配制方法参见附录 A 中 A.3。4.5 标准新城疫病毒抗原、阳性对照血清和阴性对照血清。5
4、抽样样本量大小的确定 5.1 无限群抽样样本量 n 值的计算 按照预期新城疫免疫抗体合格率为70%,可接受的最大绝对误差为5%，置信水平为95%，根据公式n=p(1-p)z2/e2计算出n值，其中z值为95%置信水平对应的标准正态分布1-/2百分位点，为1.96，将p=0.7、z=1.96、e=0.05计算出n值为323。5.2 有限群抽样样本量 n值的计算 根据公式n=nN/(N+n)，计算出群体实际抽样数量，其中N为群体数量，n为抽样数量。DB21/T 24682015 2 6 样品采集和制备 6.1 血液采集 将鸡侧卧保定后，用酒精棉球消毒翅静脉窝区，在距离翅静脉窝约0.3 cm处，使针
5、管与近心端保持45度进针，稍稍将针头轻插进血管，轻拉活塞，当有血液开始被吸出后，保持注射器位置不动，让血液缓缓吸入注射器针管内，达到所需的采血量后，用棉球压迫血管上的伤口约30 s。6.2 血清分离 采集到血液后，立即将针头拔掉，把注射器内的血液沿着试管壁徐徐注入，不能有气泡，也不能振荡。逐一编号，仔细核对，倾斜放置。血液样品夏天在常温下、冬天在25 37 温箱中放置1h左右，析出血清。6.3 血清运输 运输时将血清与采样记录一同装入隔热坚固、内装适当冷冻剂和防震材料的专用运输容器中。外包装上要加贴生物安全警示标志。6.4 血清保存 血清保存在-20-70 低温冰箱中，避免反复冻融。7 HA
6、试验方法 7.1 取新城疫病毒抗原 1 瓶，加入 2 mL PBS，充分溶解，制成新城疫病毒抗原悬液。7.2 取孔面规整、内壁光滑的 96 孔 90 度 V 型血凝反应板，在 A1C12 孔中加入 0.025 mL PBS。7.3 吸取 0.025 mL 新城疫病毒抗原悬液，加入 A1C1 孔，吹打 35 次充分混匀。7.4 从 A1C1 孔吸取 0.025 mL 加入第 A2C2 孔，混匀后吸取 0.025 mL 加入 A3C3 孔，依次进行倍比稀释至 A11C11 孔，最后从 A11C11 孔吸取 0.025 mL 弃去。7.5 A1C12 孔补加 0.025 mL PBS。7.6 A1C
7、12 孔加入 1%鸡红细胞悬液，A12C12 孔为红细胞对照。7.7 振荡混匀后，在 20 25 的条件下静置 40 min 后观察结果。7.8 当红细胞对照孔 A12C12 孔中的红细胞呈明显的钮扣状沉到孔底时，判定结果。以完全凝集红细胞的病毒抗原悬液的最大稀释倍数为该抗原的血凝滴度。完全凝集红细胞的病毒抗原悬液的最大稀释倍数为 1 个血凝单位（HAU）。8 HI 试验方法 8.1 4HAU 抗原配制 按照GB/T 16550-2008 新城疫诊断技术的要求配制4个血凝单位（4HAU）的新城疫病毒抗原。8.2 4HAU 抗原回滴 8.2.1 取血凝反应板，在 A1C5 孔加入 0.025 m
8、L PBS。8.2.2 吸取 0.025 mL 4HAU 新城疫病毒抗原，加入 A1C1 孔，混匀后倍比稀释至 A4C4 孔，混匀后吸取 0.025 mL 弃去。DB21/T 24682015 3 8.2.3 A1C5 孔中补加 0.025 mL PBS。8.2.4 A1C5 孔加入 1%鸡红细胞悬液，A5C5 孔为红细胞对照。8.2.5 振荡混匀后，在 20 25 条件下静置 40 min 后观察结果。8.2.6 当红细胞对照孔 A5C5 孔中的红细胞呈明显的钮扣状沉到孔底时，判定结果。A1C2 孔完全凝集，则 4HAU 抗原配制准确；仅 A1C1 孔完全凝集或 A1C2 孔均有红细胞流淌，
9、需补加病毒抗原；A1C3 孔或 A1C4 孔完全凝集，需补加 PBS。若 4HAU 抗原回滴出现上述后两种情况，则需要重新回滴，直至回滴准确。8.3 HI 试验操作 8.3.1 取血凝反应板，在 A1H11 孔加入 0.025 mL PBS，A12H12 加入 0.05 mL PBS。8.3.2 吸取待检血清 0.025 mL 加入 A1A6 孔中，吸取新城疫阳性血清加入 A7 孔，阴性血清加入 A8孔，混匀后，同时倍比稀释至 A10H10，混匀后弃去 0.025 mL。8.3.3 A1H11 孔加入回滴好的 4HAU 抗原，A11H11 为 4HAU 抗原对照。8.3.4 振荡混匀后，在室温
10、 2025条件下放置 30 min。8.3.5 A1H12 加入 1%鸡红细胞悬液，A12C12 孔为红细胞对照。8.3.6 振荡混匀后，在 2025条件下静置 40 min 后观察结果。9 HI 效价判定 当红细胞对照孔 A12H12 孔中的红细胞呈明显的钮扣状沉到孔底，且 4HAU 抗原对照孔 A11H11 孔完全凝集时，进行结果判定。将血凝反应板倾斜，参照对照孔，与红细胞对照孔中的红细胞泪滴大小、流速一致的血清的最高稀释倍数为该血清的 HI 效价。当阴性血清的 HI 效价不大于 2 2，阳性血清的 HI 效价与已知效价相差 1 个稀释度范围，HI 试验结果判定有效。10 免疫抗体结果判定
11、 10.1 血清 HI 效价5 2，判为新城疫免疫抗体阴性；血清 HI 效价5 2，判为新城疫免疫抗体阳性。10.2 免疫抗体合格数量占检测总数的 70%（含）以上，判该群体新城疫免疫抗体合格。DB21/T 24682015 4 A A 附 录 A（资料性附录）试剂配制 A.1 阿氏液(Alsevers Solution)葡萄糖 2.05 g 柠檬酸钠 0.8 g 柠檬酸 0.055 g 氯化钠 0.42 g 加蒸馏水100 mL，散热溶解后调pH值至6.1，69 kPa 15 min高压灭菌，4 保存备用。A.2 pH7.2 0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）A.2.1 配制25PB 磷酸氢二钠 2.74 g 磷酸二氢钠 0.79 g 加蒸馏水100 ml。A.2.2 配制1PBS 25PB 40 ml 氯化钠 8.5 g 加蒸馏水至1000 mL，调pH值至7.2，121 高压灭菌30 min或过滤，4 保存备用。A.3 1%鸡红细胞悬液 采集至少3只无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血液与等体积的阿氏液混合，用pH7.2 0.01 mol/L PBS洗涤35次，每次均以2000 rpm/min 离心10 min，洗涤后再用PBS配制成体积分数为1%红细胞悬液，4 保存备用。_
