1、 ICS 11.220 B 41 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 29722019 羊泰勒虫病病原检测 PCR 法 PCR assay for detection of theileria ovis 2019-05-27 发布 2019-06-17 实施吉林省市场监督管理厅 发 布 DB22/T 29722019 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 和 GB/T 20001.4-2015 给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位：延边大学、吉林农业科技学院、吉林省动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：贾立军、田万年、柴方红、梁晚枫、陈健、
2、王海军、王欣睿、李国峰。DB22/T 29722019 1 羊泰勒虫病病原检测 PCR 法 1 范围 本标准规定了羊泰勒虫病病原PCR检测方法原理、试剂和仪器、样品采集、操作步骤和判定结果。本标准适用于绵羊泰勒虫病病原检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 双链DNA在高温加热的作用下变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则，通过人工合成的特异性寡核苷酸引物与单链DNA模板
3、中的一段互补序列结合，形成部分双链，再利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸(dNTPs)合成新生的DNA互补链，进而完成特定片段的体外扩增。4 试剂和仪器 4.1 试剂 除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，实验用水符合 GB/T 6682 中一级水的要求。4.1.1 血液 DNA 提取试剂盒。4.1.2 10PCR 缓冲液。4.1.3 dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP），浓度 2.5 mmol/L。4.1.4 Taq DNA 聚合酶，浓度 5 U/L。4.1.5 50TAE 缓冲液见表 A.1。4.1.6 10 mg/mL 溴化乙锭见表 A.2。4.1.7 1%琼脂糖凝胶
4、见表 A.3。4.1.8 加样缓冲液见表 A.4。4.1.9 阴性对照为健康绵羊血液 DNA 提取物。4.1.10 阳性对照为羊泰勒虫感染的绵羊血液 DNA 或含有目的片段 DNA 序列，DNA 序列参见附录 B。4.1.11 空白对照为灭菌双蒸水。4.1.12 DNA Marker 分子量标准。4.2 耗材 4.2.1 抗凝管。4.2.2 吸头（200 L1 000 L、20 L200 L、2 L20 L、0.5 L10 L）。DB22/T 29722019 2 4.2.3 Eppendorf 管（1.5 mL、0.5 mL、0.2 mL）。4.2.4 PCR 反应管。4.2.5 三角瓶。4
5、.3 引物 引物序列与浓度见表 1。表1 引物序列与浓度 引物 引物序列 长度/bp 基因序列 浓度/mol/LP1（上游引物）5-TGATGAGTTGATGTATTGTGGC-3 P2（下游引物）5-TACCCGCATCCTATTTAGCAG-3 671 18S rRNA(AY262119)10 4.4 仪器设备 4.4.1 微量加样器，单道 2 L、10 L、20 L、100 L、200 L 和 1000 L。4.4.2 低温高速离心机，12 000 r/min 以上。4.4.3 PCR 扩增仪，温度范围为 4 100。4.4.4 分析天平，感量 0.1 mg。4.4.5 高压灭菌器，12
6、0 以上。4.4.6 微波炉或恒温水浴锅，室温100。4.4.7 水平电泳槽。4.4.8 电泳仪，电压 1 V300 V，电流 1 mA400 mA。4.4.9 凝胶成像系统或紫外灯。5 样品采集 用抗凝管（4.2.1）无菌采集待检绵羊血液样品5 mL，编号。冷藏条件下送实验室检测。6 操作步骤 6.1 样品 DNA 制备 按照血液DNA提取试剂盒（4.1.1）操作说明书，提取待检绵羊血液样品基因组DNA、阴性对照（4.1.9）样品基因组DNA和阳性对照（4.1.10）样品基因组DNA。6.2 PCR 检测 在PCR反应管（4.2.4）中依次加入反应试剂，PCR扩增体系为25 L，见表2。混匀
7、后置PCR扩增仪（4.4.3）中，反应条件为 96 预变性5 min，94 变性 1 min，58 退火1 min，72 延伸1 min，进行35个循环，最后72 延伸7 min，4 保存。同时设定阴性对照、阳性对照和空白对照。DB22/T 29722019 3 表2 PCR 检测反应体系 试剂 体积 10PCR 缓冲液 2.5 L 2.5 mmol/L dNTP 2.0 L 10 mol/L 上游引物 1.0 L 10 mol/L 下游引物 1.0 L 5 U/L Taq 酶 0.25 L 25 mg/L 样品 DNA 2.0 L 灭菌双蒸水 16.25 L 总体积 25 L 6.3 PCR
8、 产物电泳 将1%琼脂糖凝胶（4.1.7）板置于1TAE缓冲液的电泳槽（4.4.7）中，取加样缓冲液（4.1.8）5 L分别与 5 L 的待检绵羊血液基因组DNA样品、阴性对照（4.1.9）、阳性对照（4.1.10）和空白对照（4.1.11）的PCR产物混匀后，按编号加入到1%琼脂糖凝胶板的加样孔中，凝胶的边孔中加入标准分子量DNA Marker（4.1.12）。在 150 V 恒定电压下电泳仪（4.4.8）电泳30 min后，凝胶成像系统（4.4.9）观察结果。7 结果判定 7.1 条件 标准阳性对照出现 671 bp 的DNA扩增条带，标准阴性对照和空白对照无此扩增条带，反应结果成立。参见
9、附录C。7.2 结果 在阴性对照、阳性对照和空白对照成立条件下，若待检样品出现 671 bp 的DNA扩增条带，判为阳性，报告绵羊泰勒虫感染。若无此DNA扩增条带，判为阴性，报告绵羊泰勒虫未感染。DB22/T 29722019 4 A A 附 录 A（规范性附录）聚合酶链式反应（PCR）试验常用试剂配制 A.1 50TAE缓冲液 A.1.1 0.5 mol/L乙二铵四乙酸（EDTA）（pH 8.0）的配制见表 A.1。表A.1 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸（EDTA）（pH 8.0）乙二铵四乙酸二钠 18.6 g 灭菌双蒸水 80 mL 氢氧化钠 调 pH 至 8.0 灭菌双蒸水 定容至
10、100 mL A.1.2 TAE缓冲液（50）的配制见表 A.2。表A.2 TAE 缓冲液（50）配制 三羟甲基氨基甲烷（Tris）242 g 冰乙酸 57.1 mL 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸（EDTA）（pH 8.0）10 mL 注：加去离子水定容至100 mL，室温保存备用，使用时稀释 50为工作液。A.2 10 mg/mL溴化乙锭 10 mg/mL溴化乙锭的的配制见表 A.3。表A.3 10 mg/mL 溴化乙锭 溴化乙锭 0.1 g 水（H2O）定容至 10 mL A.3 1%琼脂糖凝胶 A.3.1 1%琼脂糖凝胶的制备见表 A.4。DB22/T 29722019 5 表A.4
11、 1%琼脂糖凝胶的制备 琼脂糖 1 g 1TAE 缓冲液 定容至 100 mL A.3.2 将三角瓶（4.2.5）放在沸水浴或微波炉（4.4.5）中加热至琼脂糖充分溶解（注意用微波炉加热时不要沸出），置室温冷却到50 左右，加入10 mg/mL溴化乙锭10 L，摇匀，倒入电泳板上，凝固后，4 备用。A.4 加样缓冲液 加样缓冲液的配制见表A.5。表A.5 加样缓冲液 溴酚蓝 10 mg 甘油 2.5 mL 0.5 mol/L pH 6.8 三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）缓冲液 定容至 10 mL DB22/T 29722019 6 B B 附 录 B（资料性附录）M 羊泰勒虫18S
12、 rRNA基因片段671 bp的DNA序列。TGATGAGTTGATGTATTGTGGCTTATTTCGGATGATACTTGTATTATCCGGATGATTACTTTGAGAAAATTAGAGTGCTCAAAGCAGGCTTTTGCCTTGAATAGTTTAGCATGGAATAATAAAGTAGGACTTTGGTTCTATTTTGTTGGTTTTAGGTACCAAAGTAATGGTTAATAGGAACAGTTGGGGGCATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAATTCTTAGATTTGTTAAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAA
13、TCAAGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCCTAACCATAAACTATGCCGACTAGAGATTGGAGGTCGTCAGTTTTTACGACTCCTTCAGCACCTTGAGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACAAAGGAAGGATTGACAGATTGATAGCTCTTTCTTGATTCTTTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAATTCCGTTAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAAATAGGATGCGGGTA 说明：横线部分为目的片段PCR扩增上游引物序列，以及下游引物的互补序列。DB22/T 29722019 7 C C 附 录 C（资料性附录）N PCR扩增产物电泳图见图 C.1。M 1 2 3 说明：MDL 2000 DNA Marker；1阴性对照；2阳性对照；3空白对照。图C.1 D _ 2000 bp-1000 bp-750 bp-500 bp-200 bp-671 bp
